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PART 01
流式細(xì)胞術(shù)簡(jiǎn)介
流式細(xì)胞術(shù)在生物學(xué)及醫(yī)學(xué)相關(guān)領(lǐng)域應(yīng)用廣泛，其以流式細(xì)胞儀為技術(shù)支撐，細(xì)胞或其他微粒與相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)蛋白或抗體結(jié)合，在特定波長(zhǎng)的發(fā)射光源激發(fā)下，熒光素會(huì)發(fā)射出特定波長(zhǎng)的光譜，這些光譜能夠被信號(hào)接收器接收，通過光電轉(zhuǎn)換器，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，從而呈現(xiàn)在軟件界面。
圖1 流式細(xì)胞儀工作原理示意圖及物理參數(shù)、熒光參數(shù)下分群效果示意圖
流式細(xì)胞術(shù)在藥物研發(fā)與治療、臨床診斷中應(yīng)用：
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細(xì)胞治療：藥代/藥效動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，了解細(xì)胞治療藥物體內(nèi)擴(kuò)增及代謝情況，了解靶細(xì)胞殺傷及重建情況，且通過分析給藥前后記憶、效應(yīng)、活化、耗竭細(xì)胞表達(dá)情況，進(jìn)一步闡釋藥物作用機(jī)理及監(jiān)控藥效；
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藥物研發(fā)和篩選：受體占位，補(bǔ)體沉積，體外毒性研究等；
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表觀遺傳學(xué)應(yīng)用：蛋白翻譯后修飾（如甲基化、乙酰化、磷酸化等），細(xì)胞通訊，鈉氫轉(zhuǎn)運(yùn)體活性，脂筏結(jié)合蛋白等；
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免疫系統(tǒng)評(píng)估：免疫分型，功能亞群評(píng)估等；
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血液疾病診斷和治療：微小殘留病，血小板，網(wǎng)織紅細(xì)胞，陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿等
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疾病診斷：CD64在感染性疾病診斷中應(yīng)用廣泛，HLA-B27與多種疾病高度相關(guān)；
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腫瘤學(xué)方向：細(xì)胞周期、凋亡、壞死、DNA倍體分析等；
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移植：組織交叉配型，HLA特異性抗體篩查，CD34+絕對(duì)計(jì)數(shù)等。
圖2 流式細(xì)胞術(shù)在藥物研發(fā)與治療、臨床診斷中的應(yīng)用
流式細(xì)胞術(shù)在自身免疫性疾病中應(yīng)用：
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自身免疫性疾病是由于免疫系統(tǒng)異常激活，產(chǎn)生針對(duì)自身組織和細(xì)胞的抗體或免疫細(xì)胞，導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙的一類疾病。常見的自身免疫性疾病有系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）、免疫性血小板減少癥（ITP）、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）、自身免疫性溶血性貧血（AIHA）、干燥綜合征（SjD）、強(qiáng)直性脊柱炎（AS）、多發(fā)性硬化癥（MS）、腎小球腎炎（GN）等。
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流式細(xì)胞術(shù)通過檢測(cè)免疫細(xì)胞數(shù)量、比例和功能狀態(tài)，從而對(duì)患者的免疫系統(tǒng)進(jìn)行監(jiān)測(cè)，評(píng)估治療的有效性和持續(xù)性，指導(dǎo)治療方案的制定和調(diào)整。
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如在系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者中，常常會(huì)出現(xiàn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的失衡；在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者中，T細(xì)胞的活化和炎癥因子的分泌增加；強(qiáng)直性脊柱炎特征是先天和先天樣免疫細(xì)胞的異?；顒?dòng)……
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如“B細(xì)胞指導(dǎo)方案”用于利妥昔單抗（RTX）治療后復(fù)發(fā)或維持治療： 通過監(jiān)測(cè)外周血CD20+/CD19+ B細(xì)胞數(shù)量，在B細(xì)胞數(shù)量恢復(fù)（CD19+ B細(xì)胞≥5個(gè)/mm3）時(shí)，追加RTX劑量，對(duì)患者維持治療、減少?gòu)?fù)發(fā)時(shí)有效。參考《利妥昔單抗在腎小球腎炎中應(yīng)用的專家共識(shí)》。
PART 02
SLE臨床治療及潛在治療靶點(diǎn)
SLE是自身免疫介導(dǎo)的、以免疫性炎癥為突出表現(xiàn)的彌漫性結(jié)締組織病，該病以血清中出現(xiàn)抗核抗體為代表的多種自身抗體及多系統(tǒng)、多器官受累為主要特征，具有極高的異質(zhì)性，臨床表現(xiàn)多樣，預(yù)后差異較大。
臨床上治療SLE的常用藥物包括糖皮質(zhì)激素（簡(jiǎn)稱激素）、免疫抑制劑、丙種球蛋白和生物制劑。生物制劑包括利妥昔單抗（抗CD20的嵌合人/鼠單克隆抗體，能清除B細(xì)胞，使多數(shù)患者出現(xiàn)至少持續(xù)4-12月的外周血B淋巴細(xì)胞減少）、貝利單抗（B淋巴細(xì)胞刺激因子(BLyS)的抑制劑，是一種重組的完全人源化IgG2λ單克隆抗體，可與可溶性BLyS高親和力結(jié)合并抑制其活性）。
圖3 SLE潛在治療靶點(diǎn)的分子途徑示意圖
注：以上內(nèi)容主要參考《風(fēng)濕免疫疾病超藥品說明書用藥專家共識(shí)(之二)——系統(tǒng)性紅斑狼瘡》
PART 03
流式細(xì)胞術(shù)在SLE治療藥物研發(fā)中的應(yīng)用
經(jīng)國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心披露臨床試驗(yàn)?zāi)驹S可用于治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡及相關(guān)適應(yīng)癥有159條（檢索截止日期：2024-11-28），涉及77個(gè)產(chǎn)品，產(chǎn)品類別涵蓋細(xì)胞治療產(chǎn)品、抗體藥物、小分子抑制劑、受體調(diào)節(jié)劑等。
流式細(xì)胞術(shù)在SLE治療藥物研發(fā)中應(yīng)用廣泛，涵蓋細(xì)胞治療產(chǎn)品的藥代/藥效動(dòng)力學(xué)監(jiān)測(cè)、抗體類藥物的受體占位研究及細(xì)胞免疫分型等研究。本文重點(diǎn)介紹SLE相關(guān)細(xì)胞功能亞群分析。
B淋巴細(xì)胞功能亞群分析：
SLE特征為自身抗體的產(chǎn)生和B淋巴細(xì)胞功能的異常，靶向B細(xì)胞治療的產(chǎn)品，通過分析B細(xì)胞功能亞群，可了解在治療前、后，患者中B細(xì)胞分化情況，并了解炎癥微環(huán)境中B細(xì)胞分化特征，為治療SLE的臨床作用機(jī)理提供相關(guān)支持。
下圖簡(jiǎn)單概述B細(xì)胞的主要亞型、發(fā)育及相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況：
圖4 B細(xì)胞的主要亞型、發(fā)育示意圖
圖片參考：Challenges and Opportunities for Consistent Classification of Human B Cell and Plasma Cell Populations. Front. Immunol. 10:2458.
圖5 B細(xì)胞的主要亞型、發(fā)育及相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)情況示意圖
圖片來自ThermoFisher官網(wǎng)：B 細(xì)胞概述
T淋巴細(xì)胞功能亞群分析：
SLE是由于過度活躍的免疫系統(tǒng)對(duì)外來刺激的反應(yīng)過于激進(jìn)，導(dǎo)致產(chǎn)生抗核抗體的B細(xì)胞和抗體反應(yīng)增強(qiáng)的T細(xì)胞處于過度興奮狀態(tài)。靶向T細(xì)胞治療及T細(xì)胞功能亞群評(píng)估對(duì)SLE臨床檢測(cè)有重要意義。
表1 目前正在研究或開發(fā)用于SLE治療的T細(xì)胞通路靶向藥物匯總表
圖片參考：T Cells in Systemic Lupus Erythematosus, Rheum Dis Clin North Am. 2021 August ; 47(3): 379–393. doi:10.1016/j.rdc.2021.04.005.
PART 04
熙寧生物|精翰生物流式平臺(tái)在SLE治療中相關(guān)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)
B淋巴細(xì)胞功能亞群分析：
B細(xì)胞功能亞群分析在靶向B細(xì)胞的細(xì)胞治療產(chǎn)品、抗體類藥物中應(yīng)用廣泛，基于文獻(xiàn)中亞群指標(biāo)有一定差異，熙寧|精翰基于文獻(xiàn)調(diào)研[1]、[2]、[3]、[4]、[5]、[6]及早期探索，開發(fā)測(cè)試panel可供參考：
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指標(biāo)：CD45，CD19，CD20，CD21，CD27，IgD，CD11c，CD38；
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亞群： Naive/Memory/Switched memory/DN2/Plasma/Age-associated B/Active na?ve；
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熙寧|精翰有SLE基質(zhì)采購(gòu)?fù)緩剑煽焖賳?dòng)方法學(xué)。
圖6 B細(xì)胞分型-技術(shù)路線
圖7 設(shè)門策略示意圖
圖8 分群效果示意圖
表2 方法學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)（特殊采血管1）
備注：測(cè)試使用SLE基質(zhì)，穩(wěn)定性可達(dá)96h，規(guī)格3mL/9mL
表3 方法學(xué)測(cè)試數(shù)據(jù)（特殊采血管2）
備注：測(cè)試使用SLE基質(zhì)，穩(wěn)定性72h，規(guī)格5mL（含檢測(cè)及備份）
表4 樣品采集及運(yùn)輸
熙寧|精翰測(cè)試方法，B細(xì)胞功能亞群穩(wěn)定性可達(dá)96h，適合多中心研究，且中心處理簡(jiǎn)單便捷，結(jié)果一致性較佳。
T淋巴細(xì)胞功能亞群分析：
熙寧|精翰已有多個(gè)T細(xì)胞功能亞群檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)，panel信息供參考：
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檢測(cè)L/D、CD45、 CD3、CD4、CD8a、CD62L、PD1、TIM3、CCR7、CD137、CD39、CD45RA、TIGIT、BTLA、CD28、CD27、CD69；
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檢測(cè)L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、CD62L、PD1、TIM3、CCR7、LAG3、CD25、CD45RA、CD27、CD69；
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檢測(cè)組1-CD80、CD86、PD-L1、CD289、CD3、CD14、CD16、CD19、CD20、CD56、CD33、CD11b、HLA-DR、CD15、CD141、CD123；組2-CD3、CD4、CD8、CD25、Ki67、Foxp3、CD45RA、CCR7、PD-1、ICOS；
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檢測(cè)組1- L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RO、CCR7、CD62L、CD27、CD28、CD69、4-1BB、CD39、CD103、HLA-DR、PD1、TIM3、CD57、CX3CR1；組2- L/D、CD45、CD3、CD4、CD8、PD1、LAG3、TIM3、CD244、CTLA-4、Tigit、CXCR5、CD57、KLRG1、CD56、CD16、CD314、CD226、CD9、CD49a、CD159a、CD335；
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CD3、CD4、CD8、HLA-DR、CD45、CD152、CD279、CD197、CD45RA、CD38；
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CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、CD127、CD45RA、CD197(CCR7)、CD45RO、CD366（Tim-3）、CD279（PD-1）、CD223（LAG-3）、TCR β。
圖9 凍存全血T細(xì)胞分型-技術(shù)路線（示例）
表5 凍存全血樣品采集&運(yùn)輸
熙寧|精翰自主開發(fā)的全血凍存方案可用于細(xì)胞亞群分析，樣品可實(shí)現(xiàn)凍存批量運(yùn)輸及檢測(cè)，相比傳統(tǒng)新鮮檢測(cè)模式，可顯著降低運(yùn)輸、檢測(cè)成本，整體運(yùn)營(yíng)成本可降低約2/3；操作簡(jiǎn)便，無需特殊儀器設(shè)備和耗材，對(duì)臨床中心要求很低。流式平臺(tái)配備光譜Cytek NL-CLC（3 激光，38通道），可實(shí)現(xiàn)多指標(biāo)同時(shí)分析，節(jié)省樣品量的同時(shí)減少分管檢測(cè)消耗的抗體、耗材等費(fèi)用，目前已有20+項(xiàng)目在光譜平臺(tái)上穩(wěn)定運(yùn)行。
PART 05
熙寧生物|精翰生物流式平臺(tái)可支持業(yè)務(wù)及相關(guān)檢測(cè)經(jīng)驗(yàn)
熙寧|精翰流式細(xì)胞團(tuán)隊(duì)由30余名經(jīng)驗(yàn)豐富的人員組成，配備BD流式細(xì)胞儀、Beckman流式細(xì)胞儀、Cytek光譜流式細(xì)胞儀等儀器和設(shè)備，支持過包括抗體類藥物、基因與細(xì)胞治療藥物、小分子創(chuàng)新藥等各類新藥的流式分析檢測(cè)，其中抗體藥物>40個(gè)，基因與細(xì)胞治療藥物>50 個(gè)，小分子創(chuàng)新藥>20 個(gè)，臨床試驗(yàn)>100 個(gè)，更是支持國(guó)內(nèi)第一款I(lǐng) 類新藥的CAR-T產(chǎn)品- 藥明巨諾倍諾達(dá)?（瑞基奧侖賽注射液）的樣本檢測(cè)分析工作。平臺(tái)能夠支持包括免疫細(xì)胞亞群分型檢測(cè)，細(xì)胞治療產(chǎn)品的PK/PD 分析，抗體藥物的受體占位分析，PD指標(biāo)蛋白磷酸化、甲基化、乙酰化檢測(cè)，胞內(nèi)因子檢測(cè)等。尤其在血液腫瘤淋巴細(xì)胞亞群檢測(cè)中具有大量的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)，歡迎咨詢溝通。
參考文獻(xiàn)：
[1] C.Wei, J. Anolik., et al., A New Population of Cells Lacking Expression of CD27 Represents a Notable Component of the B Cell Memory Compartment in Systemic Lupus Erythematosus, J Immunol 2007; 178:6624-6633, doi: 10.4049/jimmunol.178.10.6624.
[2] D. Ramsk?ld, I. Parodis, T. Lakshmikanth, et al., B cell alterations during BAFF inhibition with belimumab in SLE, EBioMedicine, https://doi.org/10.1016/j.ebiom.2018.12.035.
[3] Scott A. Jenks, Kevin S. Cashman, et al., Extrafollicular responses in humans and SLE, Immunol Rev. 2019 March; 288(1): 136–148. doi:10.1111/imr.12741.
[4] Scott A. Jenks, Kevin S. Cashman, et al., Distinct effector B-cells induced by unregulated Toll-like receptor 7 contribute to pathogenic responses in Systemic Lupus Erythematosus, Immunity. 2018 October 16; 49(4): 725–739.e6.
[5] L.Yuzi, L.zhanguo., et al., Double-negative (DN) B cells: an under-recognized effector memory B cell subset in autoimmunity, Clin Exp Immunol. 2021;205:119–127.
[6] Belouski SS, Wallace D, Weisman M, Ishimori M, Hendricks L, Zack D, Vincent M, Rasmussen E, Ferbas J, Chung J. Sample stability and variability of B-Cell subsets in blood from healthy subjects and patients with systemic lupus erythematosus. Cytometry Part B 2010; 78B: 49–58.
