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數(shù)字PCR通過單個模板分子的PCR擴增，擺脫了擴增效率的限制，可實現(xiàn)不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和參照樣本的絕對定量。作為一種準(zhǔn)確、高靈敏度的定量PCR技術(shù)，在醫(yī)學(xué)、環(huán)境科學(xué)和食品安全等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景。
PART 01
數(shù)字PCR介紹
數(shù)字PCR檢測流程可大致概括為3個步驟：
Partition 將傳統(tǒng)PCR中的單一體系進行稀釋，分散成幾萬個微滴，分散數(shù)量越多，每個單元中目標(biāo)分子濃度越高，起始低濃度靶分子的檢測可能性就越大，檢測靈敏度就越高。 Amplification 每個微滴中進行獨立的PCR擴增，檢測靈敏度提高的同時也能夠有效降低反應(yīng)體系中化合物的干擾。 Analysis 擴增結(jié)束后檢測各個獨立反應(yīng)單元的熒光信號，根據(jù)泊松分布原理進行分析，得出待測靶分子的拷貝數(shù)。
PART 02
基于泊松分布 (Poisson Distribution) 的絕對定量
數(shù)字PCR的高精確度除了與其前期樣本分散有關(guān)外，另一個重要的原因就是在數(shù)字PCR檢測分析中引入了泊松分布原理。
理論上，DNA分子可以平均分配到各獨立的反應(yīng)單元中，檢測時有熒光信號就可直接判讀為目標(biāo)分子的拷貝數(shù)。但實際操作中，DNA分子是隨機分布的，每個反應(yīng)單元可能包含兩個或兩個以上的目標(biāo)分子。
圖1 理想情況下和實際情況下DNA分子分布對比
假設(shè)反應(yīng)體系中總的靶基因拷貝數(shù)為m，獨立的反應(yīng)單元為n，每個反應(yīng)單元中靶基因拷貝數(shù)：λ=m÷n ， 由于每個單元中實際包含的靶基因拷貝數(shù)是離散的（0、1、2……），那么分區(qū)中包含k個靶基因拷貝數(shù)的概率服從泊松分布：
數(shù)字PCR采用終點法檢測，即使微滴中只含有1個靶基因拷貝也能被檢測到，儀器通過分辨各反應(yīng)單元的陰陽性情況，通過陰性反應(yīng)單元的比例和樣品稀釋倍數(shù)（或微滴數(shù)），采用泊松分布的概率公式進行計算，即可獲得樣品的拷貝數(shù)濃度，實現(xiàn)DNA的精確定量。
PART 03
數(shù)字PCR方法驗證
數(shù)字PCR以其更高的準(zhǔn)確度及靈敏度等優(yōu)勢，在基因和細胞治療產(chǎn)品的生物分析領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。2020年和2021年的《生物分析白皮書》深入討論了qPCR和dPCR之間的差異。在2021年的專家共識建議基礎(chǔ)上，2022年的GCC白皮書從CRO的角度出發(fā)，對dPCR的開發(fā)和驗證達成了更多共識。目前，數(shù)字PCR平臺建議的驗證項包括精密度、準(zhǔn)確度、靈敏度、選擇性、定量下限和穩(wěn)定性等關(guān)鍵指標(biāo)。
微滴數(shù)量（對于微滴式數(shù)字PCR）
根據(jù)使用儀器的不同，實驗可生成的微滴數(shù)量也各有差別，微滴數(shù)量過低不適用于泊松分布，檢測結(jié)果可信度也將變低，方法驗證中應(yīng)設(shè)定合適的接受標(biāo)準(zhǔn)。
標(biāo)準(zhǔn)曲線
區(qū)別于qPCR檢測，數(shù)字PCR僅在驗證階段需要在分析批中設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)曲線，用于驗證方法的準(zhǔn)確度、精密度及線性范圍；樣品分析中，數(shù)字PCR無需標(biāo)準(zhǔn)曲線參與計算即可得出待測樣品的拷貝數(shù)結(jié)果。
對于濃度≥50 copies/20 μL反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線點，接受標(biāo)準(zhǔn)為%RE在±35 %以內(nèi)，%CV ≤40%；對于濃度＜50 copies/20 μL反應(yīng)體系的標(biāo)準(zhǔn)曲線點，接受標(biāo)準(zhǔn)為%RE在±50 %以內(nèi)，%CV ≤80%。
陽性對照
分析批中使用陽性對照（包含目的基因片段的質(zhì)?；騺碜躁栃约毎幕蚪MDNA等）來監(jiān)控方法的穩(wěn)定性。
定量下限
關(guān)于dPCR的定量下限（LLOQ），GCC白皮書（2021年）和2022年《生物分析白皮書》中之前關(guān)于50 copies /μg DNA的建議仍然適用，LLOQ的測定同時也應(yīng)考慮儀器的理論%CV和背景gDNA量，以力求達到白皮書推薦的50拷貝/μg DNA靈敏度。
熒光校正
進行多通道檢測時，各熒光通道之間可能會產(chǎn)生熒光串?dāng)_，此時可通過熒光校正實驗（實驗中包含negative control和單色陽性control）進行調(diào)節(jié)。
PART 04
數(shù)字PCR技術(shù)優(yōu)勢和展望
數(shù)字PCR技術(shù)在既往的研究中凸顯出諸多優(yōu)勢：
? 反應(yīng)和結(jié)果判讀受擴增效率影響大大降低； ? 對PCR反應(yīng)抑制物的耐受能力大大提高； ? 數(shù)字PCR實驗中標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)體系分配的過程可以極大程度上降低與目標(biāo)序列有競爭性作用的背景序列濃度，適用于在復(fù)雜背景中檢測稀有突變； ? 與傳統(tǒng)熒光定量PCR相比，有更加出色的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性，在極微量核酸樣本檢測、表達量微小差異鑒定、拷貝數(shù)變異檢測等方面的應(yīng)用已被廣泛認可。
隨著科學(xué)技術(shù)的不斷進步，數(shù)字PCR系統(tǒng)正變得越來越靈活，性能在不斷提高，多重檢測與分析得到改善，相信數(shù)字PCR系統(tǒng)將很快進入臨床診斷的應(yīng)用，為生物研究提供更精準(zhǔn)可靠得核酸分子檢測與定量分析。
PART 05
熙寧生物|精翰生物PCR平臺服務(wù)方案
熙寧生物|精翰生物基因檢測平臺配備了法國Stilla Technologies公司NaicaTM crystal全自動微滴芯片數(shù)字PCR儀系統(tǒng)（Nicia Geode微滴生成/擴增系統(tǒng)&Nicia Prism3微滴讀取與分析系統(tǒng)），3色檢測系統(tǒng)，兼容多重檢測性能，靈敏度能夠達到2拷貝每反應(yīng)，可以從方法開發(fā)，方法驗證，以及樣本檢測等方面提供一站式全方位的支持。
歡迎后臺留言咨詢。
