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今年，CD3 based雙抗Tarlatamab在小細(xì)胞肺癌適應(yīng)癥上獲批，CD3 based雙抗/多抗完成了在實體瘤適應(yīng)癥上的突破，更多CD3 based T細(xì)胞驅(qū)動的療法也已涌現(xiàn)臨床。
PART 01
CD3 based雙/多特異抗體PK檢測難點
隨著新的分子實體或者新的治療方式首次進入人體，基于安全性考量，CD3 based雙抗/多抗起始給藥劑量較低，而較低的給藥劑量對雙/多特異抗體基于LBA PK檢測方法的靈敏度需求提出了挑戰(zhàn)。本文將以已上市的雙特異抗體Blinatumomab (Blincyto)的生物學(xué)分析方法為案例，討論雙/多特異抗體基于結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性原理；并以熙寧生物丨精翰生物采用的細(xì)胞平臺高靈敏度的方法學(xué)為案例，提出在劑量爬坡階段可采用Cell-based PK高靈敏分析方法作為解決方案，用于CD3 based雙抗/多抗和mRNA遞送雙抗/多抗的PK分析。
PART 02
Blinatumomab (Blincyto) PK生物學(xué)分析方法
目前在全球獲批的雙特異抗體藥物有多款，Blinatumomab是其中最早之一，用于二線治療費城染色體陰性，復(fù)發(fā)或者難治的急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）。Blinatumomab是Amgen公司基于其雙抗平臺bi-specific T-cell engagers (BiTEs)研發(fā)的雙特異抗體。從結(jié)構(gòu)上分析，Blinatumomab由一個抗CD19抗體的scFv（單鏈可變區(qū)片段）和一個抗CD3E抗體的scFv（單鏈可變區(qū)片段）通過柔性多肽共價偶聯(lián)組成圖1A, 其具體的氨基酸序列見下圖2。從功能上分析，Blinatumomab能夠同時結(jié)合ALL細(xì)胞表面的CD19抗原和T細(xì)胞表面的CD3E抗原，從而橋連T細(xì)胞接近ALL細(xì)胞，激活T細(xì)胞殺死ALL細(xì)胞圖2B。
圖1 Blinatumomab的結(jié)構(gòu)和功能
圖2 Blinatumomab的氨基酸序列
Blinatumomab由兩個ScFv組成，缺少正?？贵w的Fc端，無法通過Fc介導(dǎo)的FcRn內(nèi)吞作用來延長半衰期，相對于常規(guī)抗體長達(dá)2-3周的消除半衰期，Blinatumomab的消除半衰期非常短，只有1.25 ± 0.63小時（見表1，患者使用手提式的微型泵和端口系統(tǒng)，以4周為一個周期進行15 μg/m2/d持續(xù)的靜脈注射）。接下來本文將主要對Blinatumomab藥代動力學(xué)的分析方法進行討論。
表1 Blinatumomab的藥代動力學(xué)參數(shù)
Blinatumomab的藥代動力學(xué)分析方法不同于以配體受體結(jié)合實驗為平臺的傳統(tǒng)生物分析方法，其分析方法是基于其結(jié)構(gòu)-功能相關(guān)性MOA機理，以細(xì)胞平臺為基礎(chǔ)建立起來。簡略的過程如下：
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在輸注前后的不同時間點采集用于檢測血清Blinatumomab的血液樣品；
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血清Blinatumomab的檢測是以新激活的T細(xì)胞表面的CD69上調(diào)，采用流式進行定量分析；
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通過Blinatumomab同時結(jié)合Raji腫瘤細(xì)胞和T細(xì)胞，起到新激活T細(xì)胞的作用。
Blinatumomab的細(xì)胞學(xué)生物分析方法是基于其結(jié)構(gòu)功能特點，基于T細(xì)胞的激活需要刺激和共刺激信號。單純的Raji或者Blinatumomab與T細(xì)胞孵育反應(yīng)，均不能有效的激活T細(xì)胞導(dǎo)致T細(xì)胞細(xì)胞膜表面的CD69上調(diào)。只有采用Blinatumomab的抗CD19 ScFv一端橋接CD19+ Raji細(xì)胞, 抗CD3e ScFv一端刺激T細(xì)胞，才能利用B細(xì)胞共刺激激活T細(xì)胞，利用細(xì)胞膜標(biāo)志物CD69進行檢測。CD69在T細(xì)胞膜上的上調(diào)程度和Blinatumomab的藥物濃度呈劑量依賴關(guān)系，從而起到定量分析的作用，該細(xì)胞學(xué)的生物學(xué)分析方法的定量下限能夠達(dá)到100pg/ml。
PART 03
熙寧生物|精翰生物基于細(xì)胞平臺的生物學(xué)分析方法
熙寧生物|精翰生物自主構(gòu)建了NF-AT報告基因Jurkat穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系來替代Blinatumomab生物分析方法中的T細(xì)胞，采用相同的Raji細(xì)胞和Blinatumomab抗體，建立了Blinatumomab的細(xì)胞平臺的生物分析方法，通過激活Jurkat細(xì)胞檢測報告基因luciferase的表達(dá)，檢測化學(xué)發(fā)光信號值，Blinatumomab的劑量和化學(xué)發(fā)光信號值大小正相關(guān)，該定量方法的檢測下限能夠達(dá)到6.25pg/mL，LOD可達(dá)3pg/mL, 同時關(guān)鍵試劑僅需要標(biāo)準(zhǔn)品、現(xiàn)貨靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞，無需制備抗雙抗獨特性抗體，可快速開展，節(jié)約項目準(zhǔn)備周期。具體的數(shù)據(jù)如下圖3：
圖3 熙寧生物|精翰生物開發(fā)的Blinatumomab生物分析方法
PART 04
熙寧生物|精翰生物高靈敏Cell-based CD3 based雙抗/多抗應(yīng)用實踐
基于熙寧生物丨精翰生物自主構(gòu)建的靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞檢測體系，高靈敏Cell-based 的PK生物分析方法能夠檢測到1ug級別給藥劑量的PK血藥濃度，對于有較高細(xì)胞因子釋放風(fēng)險的CD3 based雙抗/多抗來說，是檢測低至10pg/mL級別血藥樣品的最佳選擇。目前已在多個mRNA遞送雙抗/多抗, CD3 based 雙抗/多抗IIT和I臨床項目進行應(yīng)用，有成熟方法學(xué)體系。同時通過定制靶細(xì)胞系，可實現(xiàn)TAA是CD19，或者是任意實體瘤靶點，具備靶點的廣譜適用性。方法學(xué)部分性能如下：
CLD18.2 CD3雙抗 高靈敏度方法學(xué)
圖4 熙寧生物|精翰生物開發(fā)的CD3-CLD18.2高靈敏PK方法
CD3 CD19雙抗 方法學(xué)參數(shù)
圖5 熙寧生物|精翰生物開發(fā)的CD3-CLD119臨床PK方法學(xué)性能參數(shù)
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參考文獻(xiàn)：
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[2] Zhu M , Wu B , Brandl C , et al. Blinatumomab, a Bispecific T-cell Engager (BiTE) for CD-19 Targeted Cancer Immunotherapy: Clinical Pharmacology and Its Implications[J]. Clinical Pharmacokinetics, 2016, 55(10):1271-1288.
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