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PART 01
什么是外顯子？
基因組(Genome)指一個(gè)生物體所包含DNA的全部遺傳信息，人類的基因組大小約為30億個(gè)堿基對(duì)(3Gb)?；蚪M由編碼區(qū)域(Coding Region)和非編碼區(qū)域(Non-coding Region)組成，其中非編碼區(qū)域占絕大多數(shù)。真核生物的編碼區(qū)是不連續(xù)的，包含外顯子(Exon)和內(nèi)含子(Intron)。在轉(zhuǎn)錄過(guò)程中會(huì)剪切內(nèi)含子，并拼接外顯子形成轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，并最終翻譯成蛋白質(zhì)。外顯子組(Exome)是基因組中所有外顯子的集合，是基因組中能夠轉(zhuǎn)錄出成熟RNA的部分。人類擁有約18萬(wàn)個(gè)外顯子，約占人類基因組的1%，即約3000萬(wàn)個(gè)堿基對(duì)(30Mb)。
圖1 基因外顯子和內(nèi)含子示意圖
蛋白質(zhì)編碼基因翻譯成有功能的蛋白，需要從DNA轉(zhuǎn)錄為RNA前體(pre-RNA)，進(jìn)而通過(guò)剪接形成成熟RNA(mRNA)，成熟RNA序列翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸鏈。在mRNA的兩側(cè)分別存在5'UTR和3'UTR，它們的作用是調(diào)控翻譯的啟動(dòng)和終止。雖然它們由外顯子序列構(gòu)成，但是不會(huì)被翻譯成氨基酸。 所以并非所有外顯子序列都會(huì)被翻譯成蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
圖2 pre-mRNA剪接形成成熟mRNA
PART 02
什么是外顯子組測(cè)序？
對(duì)基因組里所有的外顯子進(jìn)行測(cè)序即為全外顯子組測(cè)序(Whole Exome Sequencing，WES)，由于全外顯子序列較長(zhǎng)，通常使用高通量測(cè)序，即二代測(cè)序(Next-generation Sequencing，NGS)的方法實(shí)現(xiàn)。雖然WES所占基因組比例1%，但包含了約85%與疾病有關(guān)的變異。因此相比于全基因組測(cè)序(Whole Genome Sequencing，WGS)，WES能夠減少測(cè)序費(fèi)用的同時(shí)提高測(cè)序深度，從而以更低的成本檢測(cè)到更多的低頻變異，所以WES是比WGS更為經(jīng)濟(jì)高效的替代方法。相比于靶向測(cè)序（通常覆蓋<1000個(gè)基因），隨著新的疾病及其分子機(jī)制被不斷揭示，需要加入檢測(cè)列表的基因會(huì)越來(lái)越多，因此固定基因的靶向測(cè)序無(wú)法及時(shí)滿足多樣性的需求。WES覆蓋范圍更廣闊，理論上可以對(duì)腫瘤和遺傳疾病等所有的疾病類型進(jìn)行研究。
圖3 高通量測(cè)序儀外顯子組測(cè)序
PART 03
外顯子組測(cè)序在藥物研發(fā)中的應(yīng)用
靶向藥物患者入組檢測(cè)及生物標(biāo)志物探索
通過(guò)WES測(cè)序，可以獲得點(diǎn)突變、小片段插入或缺失、拷貝數(shù)變異和結(jié)構(gòu)變異等信息。由于包含所有基因的外顯子，WES測(cè)序全面覆蓋靶向用藥的相關(guān)位點(diǎn)，可以提供全面的用藥指導(dǎo)和耐藥信息。WES測(cè)序的檢測(cè)結(jié)果，可以針對(duì)藥物靶標(biāo)位點(diǎn)幫助藥企在藥物開發(fā)中篩選入組患者。同時(shí)，豐富的檢測(cè)數(shù)據(jù)可以幫助藥企進(jìn)行潛在生物標(biāo)志物的探索，縮短藥物研發(fā)周期，提升藥物研發(fā)效率。
以PARP抑制劑為例，同源重組修復(fù)缺陷(Homologous Recombination Deficiency，HRD)是描述同源重組修復(fù)( Homologous Recombination Repair，HRR)信號(hào)通路核心基因BRCA1/2突變、其他基因突變、啟動(dòng)子甲基化，乃至一些不明機(jī)制導(dǎo)致的患者無(wú)法通過(guò)精確的同源重組通路來(lái)修復(fù)DNA雙鏈斷裂的狀態(tài)，臨床表現(xiàn)為對(duì)PARP抑制劑高度敏感。基于WES覆蓋全的特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合中國(guó)人群相關(guān)的用于評(píng)估染色體結(jié)構(gòu)變異程度的SNPs，以此為基礎(chǔ)建立的HRD檢測(cè)策略，可精細(xì)評(píng)估腫瘤樣本中發(fā)生染色體結(jié)構(gòu)變異的程度，準(zhǔn)確檢測(cè)具有HRD特征的“基因組瘢痕”標(biāo)記，為HRD整體評(píng)估提供參考依據(jù)。HRD檢測(cè)被用于指導(dǎo)卵巢癌、乳腺癌、胰腺癌、前列腺癌等癌癥患者選擇最佳的治療方案，特別是指導(dǎo)PARP抑制劑的使用。
圖4 HRD檢測(cè)提升PARP抑制劑獲益人群
腫瘤免疫治療療效預(yù)測(cè)的生物標(biāo)志物
免疫治療已在多種腫瘤的治療中顯示出有效性和安全性，并被廣泛應(yīng)用，然而，并不是所有患者都能從免疫治療中獲益，因此需要借助特定的生物標(biāo)志物來(lái)篩選適宜人群和預(yù)測(cè)免疫治療的療效。腫瘤突變負(fù)荷(Tumor Mutational Burden，TMB)是指腫瘤基因組外顯子區(qū)域內(nèi)每百萬(wàn)堿基存在的體細(xì)胞非同義突變位點(diǎn)數(shù)量，可以間接反應(yīng)腫瘤產(chǎn)生新生抗原的能力。已有多項(xiàng)臨床研究證實(shí)，腫瘤突變負(fù)荷高的患者，更可能從免疫檢查點(diǎn)抑制劑(Immune Checkpoint Inhibitor，ICI)治療中獲益。全外顯子組測(cè)序?qū)θ嘶蚪M上全部的外顯子進(jìn)行測(cè)序，能夠全面檢測(cè)外顯子上的突變信息，是行業(yè)內(nèi)公認(rèn)的TMB檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)。今年10月12日，國(guó)內(nèi)首個(gè)獲批的NGS大Panel IVD產(chǎn)品的TMB性能評(píng)估就以WES檢測(cè)作為金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)比方法，這足以證明WES檢測(cè)的重要性。
WES檢測(cè)除了能反映TMB的情況，還包括數(shù)個(gè)其他與免疫治療療效相關(guān)的指標(biāo)，包括全面的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)和錯(cuò)配基因損傷修復(fù)(Mismatch Repair， MMR)等信息，因此通過(guò)WES測(cè)序可以多維度預(yù)測(cè)免疫治療療效。
圖5 PD-1/PD-L1抑制劑作用機(jī)制
提供個(gè)性化疫苗相關(guān)新生抗原
腫瘤新生抗原(Neoantigen)是源于腫瘤細(xì)胞中的突變基因的表達(dá)，是一類腫瘤特異性抗原，并不存在于正常的組織器官當(dāng)中。通過(guò)對(duì)腫瘤樣本和配對(duì)樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，結(jié)合改進(jìn)的生物信息學(xué)工具，通過(guò)計(jì)算樣本的突變移碼、剪接變體、基因融合、基因表達(dá)等變異，就可以預(yù)測(cè)所編碼的突變肽與樣本的MHC的結(jié)合親和力，最終得到候選的新生抗原，從而為構(gòu)建腫瘤患者特異性的腫瘤疫苗，再注射進(jìn)患者體內(nèi)以達(dá)到抑制和殺死腫瘤的目的。同時(shí)也可以聯(lián)合免疫檢查點(diǎn)抑制劑等療法使用以達(dá)到腫瘤治療最優(yōu)化。越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)腫瘤新抗原疫苗可以應(yīng)用于廣泛的癌癥類型，包括黑色素瘤、乳腺癌及肺癌等癌種，使用ICIs或化療聯(lián)合疫苗的療法也可能會(huì)更加普遍。
圖6 腫瘤新生抗原疫苗研發(fā)流程
WES檢測(cè)輔助實(shí)體瘤個(gè)性化MRD動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)
對(duì)腫瘤的復(fù)發(fā)進(jìn)行及時(shí)和準(zhǔn)確的監(jiān)控并采取干預(yù)措施，是延長(zhǎng)腫瘤患者生存期的關(guān)鍵。傳統(tǒng)的影像學(xué)和蛋白標(biāo)志物有發(fā)現(xiàn)滯后和準(zhǔn)確性低等等弊端?；赾tDNA的實(shí)體瘤MRD動(dòng)態(tài)監(jiān)控具有更高的敏感性和特異性，多項(xiàng)研究均發(fā)現(xiàn)個(gè)性化MRD動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)可以提前幾個(gè)月甚至一年于影像學(xué)提示復(fù)發(fā)。MRD通常先對(duì)腫瘤組織樣本進(jìn)行全外顯子組測(cè)序，接著基于測(cè)序發(fā)現(xiàn)的變異，篩選出腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中一直存在的變異位點(diǎn)，為每一位患者定制個(gè)性化監(jiān)控Panel，用于后續(xù)不同隨訪時(shí)間點(diǎn)血漿樣本的動(dòng)態(tài)監(jiān)控。
在藥物研發(fā)中，實(shí)體瘤MRD可以輔助篩選用藥獲益的患者，對(duì)治療效果進(jìn)行監(jiān)控，或作為臨床治療的替代終點(diǎn)。IMvigor010是羅氏制藥主導(dǎo)的一項(xiàng)全球性多中心隨機(jī)III期臨床試驗(yàn)，旨在評(píng)估阿替利珠單抗在肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌輔助治療中的作用。前期的分析結(jié)果顯示，研究沒有達(dá)到主要研究終點(diǎn)，阿替利珠單抗輔助治療不能顯著延長(zhǎng)肌層浸潤(rùn)性尿路上皮癌患者無(wú)病生存時(shí)間。然而，隨后采用常規(guī)生物標(biāo)志物，如PD-L1表達(dá)為患者分層的研究，同樣未能顯示阿替利珠單抗的臨床獲益[1]。當(dāng)研究引入個(gè)性化MRD動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)后，發(fā)現(xiàn)阿替珠單抗輔助治療能夠提高M(jìn)RD陽(yáng)性患者的DFS，MRD陰性的患者無(wú)需阿替珠單抗輔助治療[2]。這項(xiàng)研究結(jié)果說(shuō)明個(gè)性化MRD檢測(cè)準(zhǔn)確篩選出了藥物獲益的人群。
圖7 實(shí)體瘤MRD檢測(cè)篩選阿替珠單抗獲益人群
PART 04
熙寧生物|精翰生物WES檢測(cè)服務(wù)
熙寧生物|精翰生物WES檢測(cè)服務(wù)全面覆蓋變異類型，包含點(diǎn)突變、小片段插入缺失、拷貝數(shù)變異、融合變異和結(jié)構(gòu)變異，可以支持HRD檢測(cè)、TMB分析和MSI檢測(cè)，可以指導(dǎo)靶向治療和免疫治療，預(yù)測(cè)化療療效，評(píng)估遺傳風(fēng)險(xiǎn)，并進(jìn)行生物標(biāo)志物的探索，具有如下的核心優(yōu)勢(shì)：
· 基于GRCh38和GRC官網(wǎng)最新的補(bǔ)丁序列，真實(shí)覆蓋99.9%以上主流數(shù)據(jù)庫(kù)CDS區(qū)；
· 增加641個(gè)腫瘤核心相關(guān)基因的探針密度，避免關(guān)鍵基因的漏檢，檢測(cè)全面的同時(shí)節(jié)省測(cè)序成本；
· 基于中國(guó)人群遺傳背景以及療效數(shù)據(jù)開發(fā)的適合中國(guó)人群的HRD檢測(cè)位點(diǎn)，HRD檢測(cè)更準(zhǔn)確；
· 覆蓋15個(gè)經(jīng)典MSI位點(diǎn)，可支持MSI及TMB等生物標(biāo)志物探索；
· 覆蓋38個(gè)熱點(diǎn)融合相關(guān)內(nèi)含子區(qū)域，提高融合檢出陽(yáng)性率；
· 滿足低起始量、低質(zhì)量樣本建庫(kù)需求。
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參考文獻(xiàn)
[1] Bellmunt J, Hussain M, Gschwend JE, et al. Adjuvant atezolizumab versus observation in muscle-invasive urothelial carcinoma (IMvigor010): a multicentre, open-label, randomised, phase 3 trial. Lancet Oncol. 2021;22(4):525-537. doi:10.1016/S1470-2045(21)00004-8
[2] Powles T, Assaf ZJ, Davarpanah N, et al. ctDNA guiding adjuvant immunotherapy in urothelial carcinoma. Nature. 2021;595(7867):432-437. doi:10.1038/s41586-021-03642-9
