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藥物靶點（drug target）是機體內(nèi)與藥物直接接觸結(jié)合以產(chǎn)生相互作用的生物分子，通常是蛋白質(zhì)，與特定的疾病過程內(nèi)在相關(guān)。藥物靶點可以分為受體、酶、離子通道、DNA、激素與生長因子等幾種類型。藥物分子通過作用于藥物靶點并調(diào)控靶點的生物學(xué)功能進而發(fā)揮其作用。
為了評估藥物作用機制、劑量效應(yīng)和PK/PD特性，在抗體藥物研究和開發(fā)中，對人血清或血漿中游離形式靶點的準(zhǔn)確定量對于藥效學(xué)評價是至關(guān)重要的。
本文我們描述了①一種免疫耗竭藥物的方法，以準(zhǔn)確定量樣品中游離靶點的濃度。以及②一種免疫耗竭靶點有效解決基質(zhì)效應(yīng)&平行性的方法。
PART 01
雙特異性抗體藥物游離靶點的定量方法
典型LBA方法對游離靶點定量
大多數(shù)測定游離藥物靶點的方法都是基于捕獲試劑和抗體藥物競爭與靶點結(jié)合的原理。測試方法的特異性和對靶標(biāo)生物學(xué)的理解是建立可靠的游離靶標(biāo)分析方法的關(guān)鍵。
臨床前或臨床階段測定靶點可遵循以下先決條件：捕獲抗體或檢測抗體應(yīng)與藥物是否有競爭關(guān)系。
圖a 總靶點與游離靶點檢測方法對比
Total target：抗體對中兩個抗體與藥物均是非競爭關(guān)系。檢測抗體及捕獲抗體和藥物結(jié)合靶點的位點均是不相同的。
Free target：抗體對中有且只有一個與藥物是競爭關(guān)系。檢測抗體與藥物結(jié)合靶點的位點是相同的，而捕獲抗體與藥物結(jié)合靶點的位點是不同的；或捕獲抗體與藥物結(jié)合靶點的位點相同，而檢測抗體與藥物結(jié)合靶點的位點不同。
定量分析游離靶點所面臨的挑戰(zhàn)
· 基質(zhì)效應(yīng)
檢測中通過對樣品高度稀釋來減少未知來源的基質(zhì)干擾，但此方式會引起靶點-藥物復(fù)合物的解離并與檢測試劑結(jié)合，這可能導(dǎo)致對游離靶點的潛在高估。此問題有兩種解決方案：①開發(fā)較小稀釋倍數(shù)或不稀釋樣本的分析方法；②稀釋樣本并恰當(dāng)?shù)貓蟾娼Y(jié)果。
如果可行，始終優(yōu)先考慮方案①。然而在未稀釋的樣本中消除基質(zhì)干擾是一項困難的工作，因為生物基質(zhì)是復(fù)雜的，并且在血漿和血清中總蛋白濃度很高。
這里提供一種在未稀釋或較小稀釋的樣本中消除基質(zhì)干擾的思路，即使用不含內(nèi)源性分析物的血清/血漿制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，使標(biāo)準(zhǔn)曲線和樣本具有相同的基質(zhì)效應(yīng)，以解決基質(zhì)效應(yīng)問題。
獲得這種不含內(nèi)源性分析物的基質(zhì)最直接的方法是使用藥物將所有待測物耗竭掉，并避免耗竭后過量的藥物進入基質(zhì)中。圖b.一種使用磁珠耗竭基質(zhì)中內(nèi)源性靶點的方法舉例。
這種方法可以有效的解決基質(zhì)效應(yīng)，但對操作要求較高，需要摸索各種試劑濃度。
圖b 一種使用磁珠耗竭基質(zhì)中內(nèi)源性靶點的方法
步驟簡述：
1）包被藥物的磁珠耗竭基質(zhì)中的靶點；
2）空磁珠耗竭過量的包被藥物（否則藥物會對靶點的檢測有抑制作用）；
3）獲得純化后的基質(zhì)（不含靶點，不含藥物），用于配制標(biāo)曲，從而獲得了與真實樣品組分相似的標(biāo)曲，解決了基質(zhì)效應(yīng)。
· 藥物-靶點分子復(fù)合物的解離
除稀釋樣品會造成對游離靶點的潛在高估外，另一個因素是，對于某些藥物，給藥后由于機體本身的代償機制，機體會產(chǎn)生更多的靶點（total target顯著升高），以彌補給藥后靶點的虧損。由于藥物-靶點復(fù)合物在檢測過程中處于動態(tài)平衡轉(zhuǎn)化的狀態(tài)，導(dǎo)致方法檢測出從復(fù)合物中解離出來的靶點，使游離靶點被高估。
為了進一步減少靶點從復(fù)合物中解離并在檢測中產(chǎn)生的附加效應(yīng)，可以在LBA分析之前，采用某些方式對樣品進行預(yù)處理，以耗竭其中的藥物或藥物-靶點復(fù)合物，從而提高游離靶點的檢測準(zhǔn)確性。
對于雙特異性抗體藥物，可利用其對另一靶點的第二特異性選擇性地耗竭藥物或藥物-靶點復(fù)合物，對于單克隆抗體藥物，也可以使用靶點的非競爭型抗體耗竭藥物或藥物-靶點復(fù)合物。如圖c.利用磁珠預(yù)處理樣品的方法定量測定游離靶點A。
圖c 利用磁珠預(yù)處理樣品的方法定量測定游離靶點A
步驟簡述：
1）利用抗藥物另一端的抗體(抗-抗靶點B)或靶點B去耗竭樣品體系中的藥物以及藥物-靶點A；
2）藥物耗竭后的游離靶點A用free target方式進行檢測。
PART 02
按照以上方式對某雙特異性抗體藥物
游離靶點測定的簡單數(shù)據(jù)分享
注：處理前，同一個樣品經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋，濃度差異較大，基質(zhì)干擾較大。
處理后，同一個樣品經(jīng)過不同倍數(shù)的稀釋，濃度較為恒定，無基質(zhì)干擾。
PART 03
總結(jié)
使用耗竭待測靶點的空白基質(zhì)有效地解決了基質(zhì)效應(yīng)問題，同時可以允許使用較低的MRD減少了靶點與藥物的解離。
此外，通過耗竭樣品中游離藥物或藥物-靶點復(fù)合物的方式可以對游離靶點進行準(zhǔn)確定量，調(diào)整捕獲試劑和樣品孵育時間可以大大減少靶點分子從藥物-靶點復(fù)合物中解離的機會，從而減少對游離靶點的潛在高估。
此游離靶點的定量方法穩(wěn)健可靠、準(zhǔn)確、精確并且無基質(zhì)效應(yīng)，可應(yīng)用于臨床前或臨床階段項目的研究。
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