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酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)技術(shù)（Enzyme Linked Immunospot Assay，簡(jiǎn)稱ELISPOT）是細(xì)胞免疫學(xué)研究中最敏感的檢測(cè)方法，可以在單細(xì)胞水平對(duì)抗體分泌細(xì)胞(如B細(xì)胞)及細(xì)胞因子分泌細(xì)胞（如T細(xì)胞）進(jìn)行檢測(cè)，可達(dá)20-25斑點(diǎn)/100萬(wàn)細(xì)胞，由于該方法是進(jìn)行抗原刺激后免疫細(xì)胞的功能性檢測(cè)，因此也具有極佳的生理相關(guān)性。
ELISPOT常用于疫苗領(lǐng)域藥效學(xué)評(píng)估, 是mRNA感染性疫苗和mRNA/DC腫瘤疫苗藥效學(xué)評(píng)估中關(guān)鍵的技術(shù)方法，也是AAV based藥物細(xì)胞免疫原性評(píng)估重要的技術(shù)手段。
ELISPOT基本原理是通過(guò)免疫細(xì)胞和對(duì)應(yīng)刺激物進(jìn)行共培養(yǎng)，類似于ELISA雙抗夾心法對(duì)有刺激反應(yīng)的免疫細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。由于免疫細(xì)胞激活機(jī)理的復(fù)雜性性，根據(jù)免疫細(xì)胞的來(lái)源選擇，刺激物的類型，刺激方式的不同會(huì)衍生出不同的應(yīng)用方向，以及不同靈敏度的ELISPOT檢測(cè)方法，簡(jiǎn)要的技術(shù)流程如圖1所示：
圖1. ELSIPOT檢測(cè)流程圖
在基因治療藥物的臨床生物分析實(shí)踐中，細(xì)胞免疫原性檢測(cè)有諸多的難點(diǎn)：
1. ELISPOT通常需要刺激物和對(duì)應(yīng)陽(yáng)性PBMC才能進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，在實(shí)際的方法學(xué)驗(yàn)證過(guò)程中由于刺激物對(duì)應(yīng)的陽(yáng)性PBMC不易獲取，的因此有些檢測(cè)機(jī)構(gòu)的做法是，方法并不進(jìn)行驗(yàn)證。即使進(jìn)行驗(yàn)證也通常采用CEF作為刺激物，篩選健康人PBMC作為陽(yáng)性PBMC進(jìn)行方法學(xué)的精密度，穩(wěn)定性以及穩(wěn)固性驗(yàn)證，從而證明整體平臺(tái)體系的可靠性。熙寧生物秉持嚴(yán)謹(jǐn)可靠的方法開發(fā)驗(yàn)證質(zhì)量要求，除采用CEF刺激陽(yáng)性PBMC作為主體驗(yàn)證外，基于對(duì)于基因治療藥物原理的了解，在正式樣品分析前會(huì)進(jìn)行專屬于該基因治療藥物的特異性較差驗(yàn)證，如對(duì)于AAV治療藥物，會(huì)基于AAV病毒載體存在預(yù)存的陽(yáng)性PBMC，對(duì)于AAV藥物的細(xì)胞免疫原性檢測(cè)，篩選出健康人群體中的陽(yáng)性PBMC，進(jìn)行AAV衣殼蛋白多肽庫(kù)的交叉驗(yàn)證，確保在進(jìn)行樣品分析前檢測(cè)方法的可靠性。
2. ELISPOT的檢測(cè)結(jié)果會(huì)受到樣品PBMC本身的質(zhì)量的影響較大，如果PBMC分離或者保藏不當(dāng)，很可能會(huì)失去功能學(xué)活性，導(dǎo)致假陰性的結(jié)果。ELISPOT檢測(cè)結(jié)果同時(shí)受到樣品PBMC本身免疫狀態(tài)影響，如在采集時(shí)處于免疫活躍狀態(tài)，會(huì)出現(xiàn)較多的背景斑點(diǎn)，檢測(cè)結(jié)果得到的斑點(diǎn)數(shù)會(huì)是假陰性。因此，為了得到更加真實(shí)可靠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，進(jìn)行樣品分析時(shí)，如圖2所示，對(duì)于每一個(gè)樣品均會(huì)設(shè)置CD3刺激組來(lái)監(jiān)控PBMC的功能活性，Medium分組來(lái)監(jiān)控PBMC的免疫背景，在此基礎(chǔ)上進(jìn)行特定抗原的檢測(cè)分析。
圖2. ELISPOT樣品分析體系
3. ELISPOT作為最為靈敏的檢測(cè)技術(shù)，結(jié)果受到的影響因素較多，樣品進(jìn)行分析時(shí)往往會(huì)出現(xiàn)異常的數(shù)據(jù)，很多供應(yīng)商只匯報(bào)檢測(cè)斑點(diǎn)結(jié)果，并不能有效的進(jìn)行數(shù)據(jù)解讀。熙寧生物對(duì)于ELISPOT檢測(cè)技術(shù)和細(xì)胞免疫具有深刻的理解，基于CD3組的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)得到了PBMC最小響應(yīng)閾值MIR，基于Medium組的方法學(xué)驗(yàn)證數(shù)據(jù)得到最小效應(yīng)限LOD，結(jié)合實(shí)踐情況，會(huì)對(duì)每一個(gè)檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行充分的結(jié)果，，確保數(shù)據(jù)的科學(xué)性和合理性。
在基因治療藥物的臨床生物分析實(shí)踐，細(xì)胞免疫原性檢測(cè)有以下關(guān)鍵點(diǎn)：
1. 如圖3展示的T細(xì)胞激活原理，ELISPOT方法學(xué)的靈敏度跟刺激物選擇有關(guān)，通常情況方法的靈敏度的高低排序?yàn)椋卸嚯膹?fù)合物的抗原遞呈細(xì)胞>多肽>蛋白/病毒顆粒。對(duì)于腫瘤疫苗和DC疫苗，由于機(jī)體免疫細(xì)胞對(duì)其反應(yīng)比較溫和，建議使用最為靈敏的刺激物。熙寧生物有豐富的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和免疫細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，可進(jìn)行有多肽復(fù)合物的抗原遞呈細(xì)胞的培養(yǎng)和制備，設(shè)計(jì)更加復(fù)雜也更加靈敏的ELISPOT檢測(cè)方法。
圖3. T細(xì)胞激活原理
2. 在臨床檢測(cè)過(guò)程中，從全血樣品采集到分離PBMC的中間時(shí)間不應(yīng)超過(guò)8小時(shí)，不然分離出來(lái)的的PBMC的功能活性會(huì)受到極大影響，造成大部分樣品假陰性的結(jié)果。對(duì)于這個(gè)在臨床檢測(cè)分析的痛點(diǎn)，熙寧生物自主開發(fā)了相應(yīng)的方法，可將全血分離PBMC的穩(wěn)定時(shí)間延長(zhǎng)至48小時(shí)，在保證檢測(cè)結(jié)果真實(shí)可靠的前提下，滿足臨床運(yùn)營(yíng)商，從從臨床中心進(jìn)行樣本采集運(yùn)輸?shù)椒治鰧?shí)驗(yàn)室的可操作性，考察結(jié)果如4所示：
圖4. 熙寧全血穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果
細(xì)胞免疫原性評(píng)估對(duì)象是PBMC，但PBMC由于全血采集后的穩(wěn)定性較差，且免疫背景較為復(fù)雜，使得ELISPOT的檢測(cè)結(jié)果的解析變得極為復(fù)雜，甚至很多時(shí)候檢測(cè)結(jié)果本身也有失真的風(fēng)險(xiǎn)。需要基于對(duì)方法和作用機(jī)理的充分理解，來(lái)保障檢測(cè)的順利進(jìn)行。熙寧生物通過(guò)合理的樣品分組設(shè)計(jì)，方法學(xué)參數(shù)驗(yàn)證確定，會(huì)對(duì)每一個(gè)臨床樣品的檢測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行充分解讀。同時(shí)基于臨床試驗(yàn)樣品全血采集后穩(wěn)定性較短的難點(diǎn)，研發(fā)了一款全血穩(wěn)定劑，可將全血采集后的穩(wěn)定時(shí)間延長(zhǎng)到48小時(shí)，在確保樣品穩(wěn)定結(jié)果真實(shí)的情況下盡可能了便利臨床運(yùn)營(yíng)。
基因治療作為熱門的新興療法，近些年發(fā)展迅速。同時(shí)，基因治療藥物研發(fā)需求多樣化、技術(shù)復(fù)雜度高的特點(diǎn)，也對(duì)檢測(cè)分析帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。熙寧生物搭建了基于基因治療藥物檢測(cè)需求的基因檢測(cè)平臺(tái)、細(xì)胞/病毒檢測(cè)平臺(tái)、流式檢測(cè)平臺(tái)和免疫檢測(cè)平臺(tái)等，能夠滿足研發(fā)項(xiàng)目在不同階段的在生物分析需求。團(tuán)隊(duì)專注于GCT領(lǐng)域，積累了豐富的實(shí)戰(zhàn)經(jīng)驗(yàn)和專業(yè)的技術(shù)服務(wù)能力，通過(guò)qPCR/ddPCR技術(shù)、細(xì)胞法中和抗體檢測(cè)技術(shù)、ELISPOT細(xì)胞免疫原性檢測(cè)技術(shù)、流式檢測(cè)技術(shù)、ELISA/MSD檢測(cè)技術(shù)等多平臺(tái)技術(shù)互聯(lián)，打通技術(shù)隔閡，真正實(shí)現(xiàn)“一個(gè)臨床/項(xiàng)目，一個(gè)生物分析實(shí)驗(yàn)室，一個(gè)技術(shù)項(xiàng)目團(tuán)隊(duì)”的服務(wù)方式，為基因治療產(chǎn)品生物分析提供完整解決方案。
