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前言
生物療法已被批準(zhǔn)用于許多疾病的治療。與傳統(tǒng)的小分子相比，生物療法有許多優(yōu)勢，但其有可能誘導(dǎo)生物體產(chǎn)生針對自身的免疫反應(yīng)，形成抗藥物抗體（anti-drug antibodies,，ADA），進而產(chǎn)生各類副作用。中和抗體（Neutralizing antibody，NAb）是一個特殊的ADA亞種群，能夠抑制生物藥的生物活性從而減弱其藥效?？紤]到ADA和NAb會嚴(yán)重影響藥物使用的有效性和安全性，在抗體藥物研發(fā)過程中必須要進行免疫原性檢測。
基于細胞的功能性NAb試驗是一種常用段來檢測其中和活性。但是這種檢測技術(shù)往往容易受到體內(nèi)藥物循環(huán)以及來自多種血清因子（包括但不限于生長因子和疾病相關(guān)細胞因子）的干擾。因此，酸解磁珠提取法（Bead Extraction with Acid Dissociation，BEAD）被成功創(chuàng)造并應(yīng)用于從樣本中去除循環(huán)藥物或其他干擾因素，從而富集ADA/NAb。但該技術(shù)在萃取過程中使用的強酸會導(dǎo)致NAb發(fā)生不可逆變性，從而導(dǎo)致NAb的測量值被低估。為避免這一現(xiàn)象，本次將為大家介紹一種新的技術(shù)：熱解離磁珠提取法（Bead Extraction with Heat Dissociation，BEHD）。該技術(shù)通過利用不同蛋白結(jié)構(gòu)所對應(yīng)的耐熱性不同，來特異性地使藥物本身發(fā)生不可逆變性，從而使樣品中仍存在活性的ADA/NAb免疫復(fù)合物被更好地檢測到。
BEHD的實驗流程
1、將100 μL對照品或樣品添加到96孔板內(nèi)，用封板膜覆蓋， 62°C，400 rpm恒溫振蕩孵育40 - 60分鐘。
2、取出96孔板，待冷卻約15 min后，加入生物素化藥物28 μL（50 μg/mL，用含1% BSA的DPBS稀釋)，2-8℃，1000 rpm振蕩過夜。
3、將包含ADA—生物素化藥物的復(fù)合物振蕩孵育固定在250 μg鏈霉素親和素包被的磁珠上。
4、將磁珠吸附復(fù)合物用600 μL的 PBST清洗2次，用60 μL的2×RPMI-1640洗脫。
5、將50 μL洗脫液轉(zhuǎn)移到含有22 μL 100 mM HEPES的新的96孔板上。
6、后續(xù)操作參考常規(guī)實驗步驟。
實驗結(jié)果
1、實驗藥物和陽性對照的熱穩(wěn)定性
藥物和NAb對于溫度的耐受差異是BEHD的一個核心問題。因而，本文首先比較了實驗藥物與多組抗實驗藥物的NAb PCs（陽性抗體）的熱穩(wěn)定性。如圖1A和表1所示，實驗藥物在62°C幾乎都已變性，而大部分NAb PCs在此溫度下仍能保持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。其中熱穩(wěn)定性最佳的為Rabbit pAb NAb PCs。
為了進一步確認實驗藥物和NAb PCs熱穩(wěn)定性的不同，將兩者在不同溫度下加熱50-60 min，然后檢測藥物和NAb PCs剩余活性。如圖1B和1C所示，在62°C的情況下，濃度等于或低于0.5 μg/mL的藥物其活性顯著降低。相反，不同劑量的NAb PCs在所測試的溫度下都保留了活性。
上述結(jié)果表明，在62°C下，大多數(shù)藥物發(fā)生了不可逆的變性，而所有檢測的NAb PCs仍能保留活性。
2、加熱代替酸處理提高抗實驗藥物 NAb的回收率
BEHD與BEAD的主要區(qū)別在于第一步是對樣品進行熱處理或酸處理。為了評估熱處理與酸處理的效果，作者比較了經(jīng)兩種手段分別處理后的Rabbit pAb Nab PCs的相對活性。如表2所示，62°C加熱分解藥物/NAb免疫復(fù)合物后，NAb的相對活性明顯優(yōu)于酸處理。
那是否是因為這類Rabbit pAb Nab PCs對酸處理過于敏感導(dǎo)致其不適用于酸處理的方法呢？因此，作者設(shè)計了一種在較低pH環(huán)境下能保持更高活性的PC——13H4。從表2可知，13H4在兩種處理下的表現(xiàn)也如同之前的PCs一樣。這表明相較于酸處理，熱處理更能保持NAb的相對活性，提高其回收率。
表2
結(jié)論
隨著生物藥物結(jié)構(gòu)、作用位點的不斷創(chuàng)新，許多ADA/NAb陽性抗體不能承受苛刻的酸處理，這直接導(dǎo)致了ADA/NAb回收率低，例如有聚乙二醇化結(jié)構(gòu)域的抗體就不耐受低pH的環(huán)境。因此創(chuàng)造一種不基于“酸處理”的方法顯得十分重要。在本文中，作者也驗證了熱解離磁珠提取法（BEHD）法具有良好的耐藥性、精密度和靈敏度，可應(yīng)用于免疫安全性檢測實驗中。然而，該方法也存在一定局限性。此方法的前提是實驗室需具備特殊儀器用于檢測相關(guān)蛋白的耐熱情況。并且，它只適用于ADA/NAb陽性抗體的耐熱性高于藥物蛋白本身的實驗方法。
同時，該方法跳出常規(guī)實驗思路，從蛋白的基本物理性質(zhì)層面去優(yōu)化實驗步驟，也為我們之后的方法開發(fā)提供了一個新角度。
參考文獻
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