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配體結(jié)合分析實(shí)驗(yàn)（Ligand Binding Assay，以下簡(jiǎn)稱LBA）廣泛應(yīng)用于大分子生物藥物領(lǐng)域，在藥代動(dòng)力學(xué)分析、免疫原性和生物標(biāo)志物分析中占據(jù)重要的地位，貫穿了生物藥臨床前到臨床上市監(jiān)測(cè)的整個(gè)過程。關(guān)鍵試劑是整個(gè)LBA方法的基石，在實(shí)際的檢測(cè)分析中，往往會(huì)遇到批次更換的情況。本文將主要從關(guān)鍵試劑批次變化對(duì)方法性能產(chǎn)生的影響及對(duì)產(chǎn)生的影響如何進(jìn)行評(píng)估進(jìn)行闡述。
關(guān)鍵試劑（critical reagent），從字面意思理解，是指分析過程中對(duì)方法的性能及參數(shù)表現(xiàn)至關(guān)重要的試劑。監(jiān)管機(jī)構(gòu)和一些文獻(xiàn)也提出將某些試劑確定為關(guān)鍵試劑，關(guān)鍵試劑一般包括結(jié)合蛋白，配子（寡核苷酸，多肽鏈），抗體或標(biāo)記物等。生物分析業(yè)界沿用并擴(kuò)大這一定義，包括多肽，如受體或配體，及它們的片段; 酶偶聯(lián)物; 和在某些情況下的生物基質(zhì)。
關(guān)鍵試劑管理涉及試劑采購、儲(chǔ)存、變更和穩(wěn)定性等各個(gè)方面，而關(guān)鍵試劑是LBA方法性能穩(wěn)定表現(xiàn)的基礎(chǔ)，當(dāng)其發(fā)生變化時(shí)可能會(huì)改變方法的性能，從而影響分析結(jié)果。法規(guī)和各大指導(dǎo)原則也對(duì)關(guān)鍵試劑都提出了一些要求，在獲得關(guān)鍵試劑時(shí)，其質(zhì)量需有合適的表征和記錄，文件至少包含但不限于名稱、批號(hào)、來源、純度、濃度（如有）或滴度、親和力、分子量、儲(chǔ)存條件和有效期等。關(guān)鍵試劑發(fā)生改變時(shí)，須通過生物分析評(píng)估，確認(rèn)方法性能不變，保證測(cè)定結(jié)果與原關(guān)鍵試劑的一致性。
在LBA方法中，通常不可避免會(huì)引入新批號(hào)的關(guān)鍵試劑，例如原始批號(hào)的關(guān)鍵試劑使用完、試劑廠家倒閉或者不再生產(chǎn)該試劑等。避免這種情況最有效的方式是提前備足貨，保證完成整個(gè)試驗(yàn)階段。然而，現(xiàn)實(shí)中更常見的是，會(huì)出現(xiàn)一些可預(yù)見或者不可預(yù)見的情況使我們不得不在項(xiàng)目進(jìn)行中更換試劑批號(hào)或來源。這時(shí)，對(duì)關(guān)鍵試劑的變更評(píng)估是非常有必要的。我們需要預(yù)先在SOP或者項(xiàng)目方法方案中建立其評(píng)估方法和接受標(biāo)準(zhǔn)，科學(xué)的對(duì)關(guān)鍵試劑進(jìn)行變更評(píng)估。下面是評(píng)估關(guān)鍵試劑的兩個(gè)層面，包括微小變更（minor change）和重大變更（major change）。
微小變更
試劑的微小變更是對(duì)方法性能影響極小的改變，不會(huì)對(duì)數(shù)據(jù)生成產(chǎn)生影響。這些微小變更如試劑批次變更，新批次和原批次的源頭是一樣的（如：來自同一原液或者細(xì)胞系）；新舊批次的制備流程也是一樣的（如：從相同動(dòng)物中提取的多克隆血清進(jìn)行新的一次親和純化，或者使用相同的偶聯(lián)流程對(duì)相同批次的蛋白進(jìn)行一次新的偶聯(lián)）。
第一個(gè)層面包含關(guān)鍵試劑中共有的測(cè)試（圖1）。單個(gè)關(guān)鍵試劑批號(hào)的變更，對(duì)于PK和biomarker分析，建議進(jìn)行一個(gè)準(zhǔn)確度和精密度實(shí)驗(yàn)，最好包括定量下限和定量上限在內(nèi)的5個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品；對(duì)于ADA分析，應(yīng)包括接近陰性質(zhì)控，高濃度和低濃度陽性對(duì)照樣品的3個(gè)濃度水平的質(zhì)控樣品。如果多個(gè)試劑批號(hào)的變更，可以使用同一方法在同一個(gè)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行資質(zhì)確認(rèn)。在這種情況下，建議進(jìn)行至少2個(gè)測(cè)試，以提高測(cè)試結(jié)果的可信度。在可能的情況下，對(duì)新批次和原始批次的關(guān)鍵試劑做平行測(cè)試，對(duì)監(jiān)控分析方法性能的變化趨勢(shì)非常有用。當(dāng)然這種平行實(shí)驗(yàn)不一定是必需的，也可以通過趨勢(shì)分析來考察，但不建議作為評(píng)估實(shí)驗(yàn)的接受標(biāo)準(zhǔn)。在測(cè)試結(jié)果不符合接受標(biāo)準(zhǔn)的情況下，可以通過重新配制標(biāo)準(zhǔn)樣品和質(zhì)控樣品進(jìn)行一次新的測(cè)試；如果重新測(cè)試的結(jié)果滿足接受標(biāo)準(zhǔn)通?？烧J(rèn)為評(píng)估完成，建議是再進(jìn)行一次測(cè)試，以增加測(cè)試結(jié)果的可信度。如果重新測(cè)試的結(jié)果不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，可能存在兩種可能性：一是制備新批次的試劑不可用；二是試劑的本身出現(xiàn)了變化，需要重新優(yōu)化方法，這種情況將視為重大變更的層面了。在沒有原始批次的關(guān)鍵試劑的情況下（圖2），對(duì)質(zhì)控的監(jiān)控就變得更加關(guān)鍵了。當(dāng)新批次關(guān)鍵試劑的測(cè)試實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了可接受的數(shù)據(jù)，其結(jié)果也可作為能夠接受試劑更換的記錄。
重大變更
試劑的重大變更是對(duì)方法性能影響極大的改變，最常見的是不能獲得原始廠家的試劑，需要更換其他廠家的同類試劑的情況；還包括從新動(dòng)物獲得的新的血清，使用新的克隆株生產(chǎn)新的抗體，或使用新的細(xì)胞系表達(dá)重組蛋白等。另外還需要關(guān)注一種情況，當(dāng)ADA分析中更換新批次的陰性質(zhì)控，也可能對(duì)分析方法的性能產(chǎn)生重大影響。對(duì)關(guān)鍵試劑的重大變更也應(yīng)采取以下步驟（圖1）：至少進(jìn)行3個(gè)分析批測(cè)試，每一個(gè)分析批需平行測(cè)試新試劑和原始試劑。如果新試劑測(cè)試結(jié)果不滿足接受標(biāo)準(zhǔn)，我們需評(píng)估測(cè)試結(jié)果失敗的原因，例如試劑結(jié)合能力或者親和力的差異導(dǎo)致原標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量范圍不合適了；試劑與分析體系中的非特異性結(jié)合增加，使本底信號(hào)增加等等。在適用于研究目的的前提下，新的試劑還是可以使用的，但需對(duì)分析方法進(jìn)行優(yōu)化和部分驗(yàn)證。在沒有原始批次的關(guān)鍵試劑的情況下（圖2），新批次的關(guān)鍵試劑需要進(jìn)行部分驗(yàn)證，若新批次關(guān)鍵試劑的測(cè)試實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生了可接受的數(shù)據(jù)，其結(jié)果也可作為能夠接受試劑更換的記錄。對(duì)于PK和biomarker分析，部分驗(yàn)證包括至少3個(gè)精密度和準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)，選擇性等；對(duì)于ADA分析，部分驗(yàn)證包括至少臨界值確認(rèn)，精密度，選擇性和耐藥性等。
支持新藥開發(fā)的生物分析方法可能跨越幾年，甚至十幾年，因此，我們需要在分析方法和項(xiàng)目生命周期管理的背景下，考慮關(guān)鍵試劑的管理。本文根據(jù)現(xiàn)有監(jiān)管機(jī)構(gòu)指南、相關(guān)白皮書，對(duì)關(guān)鍵試劑批號(hào)變更的做法及評(píng)估進(jìn)行了一個(gè)簡(jiǎn)單的總結(jié)，為項(xiàng)目中關(guān)鍵試劑變更的問題提供參考。
參考文獻(xiàn)
1.King, L, et al., Ligandbinding assay critical reagents and their stability: recommendations and bestpractices from the Global Bioanalysis Consortium Harmonization Team. The AAPSjournal, 2014. 16(3): p. 504-15.2. DeSilva B, et al.
2.EBF recommendation on practical management of critical reagents for antidrug antibody ligand-binding assays. Bioanalysis. doi:10.4155/bio-2019-0248
圖1
圖片來自Lindsay E. King, et al. The AAPS Journal, Vol.16, No.3, May 2014.
圖2
圖片來自Susnne Pihl, et al. Bioanalysis, White Paper, doi:10.4155/bio-2019-0248
