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熙寧小課-第82期 | 基于人血清/的補(bǔ)體功能臨床藥效學(xué)測(cè)定旁路途徑檢測(cè)分析 -臨床階段的藥效學(xué)評(píng)估檢測(cè)方法系列3
前言
補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的重要部分，在病原體免疫監(jiān)測(cè)和維持組織穩(wěn)態(tài)中起著重要作用。補(bǔ)體系統(tǒng)識(shí)別免疫復(fù)合物、受損細(xì)胞或病原微生物的分子信號(hào)，繼而觸發(fā)蛋白水解級(jí)聯(lián)反應(yīng)。該級(jí)聯(lián)反應(yīng)由三條途徑組成，分別稱為經(jīng)典途徑、凝集素途徑和替代途徑（CP、LP和AP）。補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)量激活或者失調(diào)可能導(dǎo)致一系列的疾病發(fā)生。 隨著Alexion研發(fā)的首款C5補(bǔ)體抑制劑Sorilis以及后續(xù)長(zhǎng)效的C5補(bǔ)體抑制劑Ultomiris的成功，Apellis研發(fā)的首款C3補(bǔ)體抑制劑Empavel成功上市，補(bǔ)體系統(tǒng)的藥物研發(fā)成為越來(lái)越熱的賽道。本文簡(jiǎn)單盤點(diǎn)下目前補(bǔ)體系統(tǒng)藥物研發(fā)的熱門靶點(diǎn)，從臨床前和臨床階段藥效學(xué)分析方法的角度介紹下基于人血清/紅細(xì)胞裂解的補(bǔ)體功能藥效學(xué)測(cè)定旁路途徑檢測(cè)分析。
補(bǔ)體抑制劑藥物研發(fā)進(jìn)展
針對(duì)補(bǔ)體系統(tǒng)的過(guò)量激活開發(fā)了大量的補(bǔ)體信號(hào)通路關(guān)鍵分子的抑制劑，目前走在前列的是靶向C5,C3,C1S等抑制劑已成功上市，適應(yīng)癥主要集中在PNH, aHUS, myasthenia gravis等領(lǐng)域，同時(shí)隨著新藥研發(fā)的進(jìn)程，在一期二期臨床階段，靶向FactorB，F(xiàn)actorD, MASP2補(bǔ)體系統(tǒng)新型抑制劑也在快速推進(jìn)，部分補(bǔ)體系統(tǒng)的藥物研發(fā)見(jiàn)圖1，補(bǔ)體藥物正當(dāng)時(shí)。
圖1：補(bǔ)體抑制劑的研發(fā)進(jìn)展
補(bǔ)體抑制劑作用機(jī)理和藥效學(xué)分析方法
如圖2所示，補(bǔ)體系統(tǒng)的激活主要由三條路徑組成：
圖2：補(bǔ)體系統(tǒng)的三條激活路徑
1. 經(jīng)典途徑（CP）：
經(jīng)典途徑需要機(jī)體的抗體（通常為IgM，或者多聚化的IgG）和特定的抗原形成復(fù)合物后啟動(dòng)，首先被補(bǔ)體系統(tǒng)中的識(shí)別單位：包括C1q、C1r、C1s識(shí)別；然后通過(guò)活化單位：包括C2、C3、C4形成級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最后由膜攻擊單位：包括C5、C6、C7、C8和C9，通過(guò)蛋白水解酶的作用形成復(fù)核物結(jié)合到細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜損傷破碎。
2. 凝集素途徑 (LP)：
凝集素途徑由機(jī)體的甘露聚糖結(jié)合凝集素（mannan-binding lectin,MBL）或纖維膠凝蛋白（ficolin，F(xiàn)CN）直接識(shí)別多種病原微生物表面的甘露糖、N-乙酰甘露糖、N-乙酰葡萄糖氨、巖藻糖等為末端糖基的糖結(jié)構(gòu)。MBL-MASP復(fù)合物與病原體表面糖結(jié)構(gòu)結(jié)合，使MASP-1、MASP-2被獨(dú)立地激活?；罨腗ASP2發(fā)揮其活性，裂解C4，所產(chǎn)生的C4b片段共價(jià)結(jié)合于病原體表面，通過(guò)與C2相互作用，使后者也被MASP2裂解，形成C3轉(zhuǎn)化酶C4b2a，繼之活化補(bǔ)體CP；活化的MASP1能直接裂解C3產(chǎn)生C3b，在fD和fP的作用下，形成C3轉(zhuǎn)化酶C3bBb或C3bBbP，并產(chǎn)生C5轉(zhuǎn)化酶C3bBb3b，激活補(bǔ)體AP。
3. 旁路途徑 （AP）:
旁路途徑在正常生理情況下，機(jī)體的C3與B因子、D因子等相互作用，可緩慢的產(chǎn)生極少量的C3B和C3bBb（旁路途徑的C3轉(zhuǎn)化酶），但迅速受H因子和I因子的作用，不再能激活C3和后續(xù)的補(bǔ)體成分。
旁路途徑的激活在于激活物質(zhì)（例如細(xì)菌脂多糖、肽聚糖；病素感染細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞，痢疾阿米巴原蟲等）的出現(xiàn)。激活物質(zhì)的存在為C3b或C3bBb提供不易受H因子置換Bb，不受Ⅰ因子滅活C3b的一種保護(hù)性微環(huán)境，使旁路激活途徑從和緩進(jìn)行的準(zhǔn)備階段過(guò)渡到正式激活的階段。
當(dāng)C3被激活物質(zhì)激活時(shí)，其裂解產(chǎn)物C3b又可在B因子和D因子的參與作用下合成新的C3bBb。后者又進(jìn)一步使C3裂解。由于血漿中有豐富的C3，又有足夠的B因子和Mg2 ，因此這一過(guò)程一旦被觸發(fā)。就可能激活的產(chǎn)生顯著的擴(kuò)大效應(yīng)。有人稱此為依賴C3Bb的正反饋途徑，或稱C3b的正反饋途徑，激活效應(yīng)將持續(xù)擴(kuò)大。
在進(jìn)行補(bǔ)體系統(tǒng)的新藥研發(fā)過(guò)程中，針對(duì)不同的藥物靶點(diǎn)，因處于補(bǔ)體激活信號(hào)通路的不同位置，甚至其靶向的補(bǔ)體路徑不一樣，需要采用不同的補(bǔ)體激活藥效血評(píng)估方法進(jìn)行評(píng)估，這需要基于藥物的作用機(jī)理和補(bǔ)體激活路徑的充分了解下進(jìn)行選擇；同時(shí)由于補(bǔ)體激活的三條激活路徑在活化和膜攻擊進(jìn)程中會(huì)共用部分信號(hào)分子，檢測(cè)方法的特異性需要進(jìn)行充分的評(píng)估。
C3抑制劑Empaveli的臨床藥效學(xué)分析方法解析
上市藥物Empaveli的藥物作用機(jī)理如圖3靶向補(bǔ)體蛋白C3，阻斷C3進(jìn)一步活化，從而抑制補(bǔ)體信號(hào)通路的激活。由于C3蛋白的活化是經(jīng)典路徑，凝集素路徑和旁路途徑共有，Empaveli可以同時(shí)抑制三條補(bǔ)體激活信號(hào)通路，跟三條信號(hào)通路相關(guān)的活性分析方法均能夠表征其藥效。
圖3：Empaveli的藥物作用機(jī)理
從Empaveli披露的文獻(xiàn)信息，其藥效學(xué)檢測(cè)分析方法只要進(jìn)行了C3活性，CH50和AP50的檢測(cè)。
從Empaveli公布臨床前前的藥效學(xué)數(shù)據(jù)來(lái)看主要的依據(jù)是旁路途徑的溶血試驗(yàn)抑制效果。
圖4：Empaveli臨床藥效學(xué)數(shù)據(jù)
臨床階段的旁路途徑的溶血試驗(yàn)的難點(diǎn)分析：
1. 旁路途徑溶血試驗(yàn)相對(duì)于經(jīng)典途徑溶血試驗(yàn)，沒(méi)有加特異性的抗體形成復(fù)核物激活C1q，溶血的效果相對(duì)較差，方法的區(qū)分度會(huì)較差。
2. 旁路途徑溶血試驗(yàn)沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)體系變化的校準(zhǔn)，采用不同來(lái)源，不同批次的sheep紅細(xì)胞，樣品血清的檢測(cè)溶血結(jié)果可能會(huì)有差異。
3. 不同個(gè)體旁路途徑的活性不一樣，藥物引起的效果將不太一樣，個(gè)體差異較大?？赡軙?huì)出現(xiàn)低活性個(gè)體沒(méi)有藥效的情況。（如圖4，個(gè)別健康個(gè)體用藥后，藥物對(duì)個(gè)體的旁路補(bǔ)體活性無(wú)顯著性影響）
4. 旁路途徑為無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品的非定量實(shí)驗(yàn)，不同分析批的結(jié)果可能會(huì)有比較大的差異，在進(jìn)行臨床用藥前和用藥后的樣品進(jìn)行旁路活性比較時(shí)，分析批間的差異將會(huì)較大的影響的結(jié)果。
5. 旁路途徑溶血試驗(yàn)的特異性需要得到證明，以避免經(jīng)典途徑和凝集素途徑的干擾
熙寧生物的補(bǔ)體系統(tǒng)臨床前和臨床藥效學(xué)分析服務(wù)
熙寧生物有豐富的臨床階段基于人血清樣品進(jìn)行補(bǔ)體信號(hào)通路藥效學(xué)評(píng)估的方法開發(fā)，驗(yàn)證和樣品分析的經(jīng)驗(yàn)?？商峁┭a(bǔ)體激活信號(hào)通路中經(jīng)典途徑，凝集素途徑和旁路途徑的藥效學(xué)分析服務(wù)，部分藥效學(xué)分析結(jié)果如下：
如上圖人血清中的補(bǔ)體功能有顯著性的個(gè)體差異，在進(jìn)行藥效學(xué)檢測(cè)數(shù)據(jù)分析時(shí)需基于個(gè)體的補(bǔ)體功能，對(duì)藥物的效果和離群值進(jìn)行有效的區(qū)分。
基于人血清的補(bǔ)體信號(hào)通路藥效學(xué)評(píng)估模型可對(duì)藥物首次人體用藥的劑量進(jìn)行外推和預(yù)測(cè)，是臨床前轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究到臨床階段早期藥效評(píng)估的重要橋梁。
