中文
1.簡介
蛋白質(zhì)甲基化
蛋白質(zhì)甲基化一般指精氨酸或賴氨酸在蛋白質(zhì)序列中的甲基化，是翻譯后修飾的一種形式。精氨酸可以被甲基化一次（稱為一甲基精氨酸）或兩次（精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（PRMTs）將兩個甲基同時轉(zhuǎn)移到精氨酸多肽末端的同一個氮原子上成為非對稱性甲基精氨酸，或者在每個氮端各加一個甲基成為對稱性二甲基精氨酸），賴氨酸經(jīng)賴氨酸轉(zhuǎn)移酶的催化可以甲基化一次、兩次或三次。組蛋白甲基化是指發(fā)生在H3和H4組蛋白N端Arg或Lys殘基上的甲基化，由組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)催化。某些組蛋白殘基通過甲基化可以抑制或激活基因表達，從而形成為表觀遺傳。
H3K27me3
組蛋白H3第27位賴氨酸三甲基化（Trimethylated Histone H3 at Lysine 27）是最常見的組蛋白甲基化修飾之一，由多梳抑制復(fù)合物2（Polycombrepressive Complex 2，PRC2）產(chǎn)生，而PRC2組成部分的改變，如Zeste基因增強子人類同源物2（Enhancer of Zeste Homolog2，EZH2）功能改變或過表達會使H3K27me3表達失衡，細胞增殖分化失控，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。EZH2是多梳蛋白家族（Polycomb Groups，PcG）的核心催化亞基，通過組蛋白甲基的一個高度保守區(qū)域SET催化組蛋白H3K27發(fā)生甲基化，從而使抑癌基因表達下調(diào)。
H3K27me3的檢測方法
目前H3K27me3檢測方法主要有Western Blot、免疫組織化學(xué)（IHC）、染色質(zhì)免疫沉淀-測序（ChIP-Seq）、流式細胞術(shù)（FCM）等，其中FCM具有分析能力強和多參數(shù)的特點，可同時檢測到H3K27me3水平在多個細胞群中表達量的差異。目前，F(xiàn)CM多與Western Blot聯(lián)合用于EZH2抑制劑的藥效學(xué)研究，評估該類型藥物對多個細胞群組蛋白甲基化水平的影響。隨著細胞通路研究的深入，F(xiàn)CM有望在單細胞水平直接檢測胞內(nèi)H3K27me3的表達水平。
流式細胞術(shù)（Flow Cytometry）
是一種對細胞群體中的單個細胞或類似細胞大小的顆粒進行快速、連續(xù)檢測的技術(shù)。其基本原理是：細胞或其他微粒與相應(yīng)的熒光素偶聯(lián)蛋白或抗體結(jié)合，基于層流規(guī)律的流體動力學(xué)聚焦樣本形成單細胞流，將單細胞隊列快速傳輸至激光光源與液流正交的位置時，在特定波長的發(fā)射光源激發(fā)下，形成多角度散射光，和細胞攜帶的各種熒光染料被激發(fā)發(fā)出特征熒光，這些光譜能夠被機器的信號接收器接收，通過光電轉(zhuǎn)換器，將光信號轉(zhuǎn)換為電信號。儀器收集、和測量眾多單細胞的散射光和熒光信號并進行關(guān)聯(lián)分析。
流式細胞術(shù)應(yīng)用廣泛，包括細胞亞群比例及濃度測定、細胞功能分型（活化、耗竭、分化時態(tài)、免疫檢查點等）、細胞功能相關(guān)實驗（細胞增殖、凋亡、周期、鈣流、殺傷、吞噬功能等）、胞內(nèi)染色（胞內(nèi)因子、核內(nèi)因子、胞內(nèi)活化激酶等）、分泌細胞因子檢測（流式液相多重蛋白定量CBA技術(shù)）、微生物學(xué)檢測（細菌、真菌、病毒等鑒定，微生物活性等）、表觀遺傳學(xué)相關(guān)檢測等。
基本檢測原理
使用熒光素偶聯(lián)的抗H3K27me3抗體和抗Total H3抗體，通過流式分析H3K27me3/Total H3的MdFI比值，反應(yīng)細胞甲基化的強弱。且通過標記不同細胞亞群，評估給藥后的甲基化變化情況，結(jié)果更具有代表意義。
圖1：流式設(shè)門圖舉例
圖2：人外周血中甲基化基線水平示意圖
2. H3K27me3檢測用于臨床早期藥效評估
在臨床轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究過程中，人外周血作為最容易獲取的生物基質(zhì)，是用于進行臨床早期用于評價藥理藥效的作為重要的生物基質(zhì)。根據(jù)已上市EZH2抑制劑藥物Tazemetostat披露的研究資料，采用流式細胞術(shù)方法檢測進行用藥后人外周血中特定細胞亞型的H3K27me3水平，如圖3所示，Tazemetostat用藥后，在中性粒細胞和單核細胞中，H3K27me3水平有明顯的下降，而在T細胞中，H3K27me3水平?jīng)]有明顯變化。
圖3：Tazemetostat對PBMC中不同亞型細H3K27me3水平的影響
3. 常用的標本類型和處理方法
人外周血：抗凝采血管進行采集，樣品經(jīng)裂紅、固定、破膜等處理后，可于-70℃中長期保存、批量分析。對樣品運輸時效要求相對較高，臨床中心具備相關(guān)處理能力時，可節(jié)省運輸成本，但需保證各臨床中心操作的一致性。
4. 實驗流程
本文闡述釋通用型方法驗證的相關(guān)實驗流程，即使用抗凝全血進行H3K27me3相關(guān)檢測流程。
01采集適量新鮮的抗凝全血。
02取出適當體積的新鮮全血，加入適當體積的細胞裂紅固定液進行裂紅、固定，洗滌，破膜。
03破膜后的樣品可用于檢測或轉(zhuǎn)入凍存管中于-70℃冰箱長期保存。
04封閉液封閉，表面/胞內(nèi)/核內(nèi)抗體孵育。
05上機，使用流式細胞儀進行樣品檢測。
5. 精翰生物部分測試數(shù)據(jù)展示
1.室溫儲存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
以上僅為某個方法開發(fā)數(shù)據(jù)舉例，在不同細胞亞群中穩(wěn)定性結(jié)果有差別，至48小時，T/B/NK/粒細胞/單核穩(wěn)定（%CV＜35%），其中，粒細胞、單核細胞指標，至72小時穩(wěn)定。
圖4：粒細胞中測試結(jié)果示意圖（MdFI信號比值）
圖5：單核細胞中測試結(jié)果示意圖（MdFI信號比值）
2.破膜后-70℃凍存穩(wěn)定性數(shù)據(jù)
以上僅為某個方法開發(fā)數(shù)據(jù)舉例，采集全血樣品，經(jīng)裂紅固定、Perm處理后，-70℃凍存保存2個月MdFI比值在T/B/NK/粒細胞亞群中均較穩(wěn)定。
圖6：-70℃凍存儲存2個月穩(wěn)定性數(shù)據(jù)示意圖，更長時間的凍存穩(wěn)定性待測試
6.應(yīng)用
H3K27me3是SCLC化療耐藥性的潛在治療靶點：在一項小細胞肺癌（SCLC）化療機制的研究中發(fā)現(xiàn)，H3K27me3可通過調(diào)節(jié)HOX轉(zhuǎn)錄反義RNA（HOTAIR）促使HOXAI DNA 甲基化進而誘導(dǎo)SCLC的多藥耐藥性。
H3K27me3是腫瘤治療的重要預(yù)后指標：在一項鼻咽喉癌（NPC）放化療后的研究中發(fā)現(xiàn)，H3K27me3的高表達與NPC患者的生存期縮短密切相關(guān)，提示H3K27me3可作為預(yù)測NPC放化療反應(yīng)和患者預(yù)后的免疫標志物。然而，在結(jié)腸癌化療中發(fā)現(xiàn)，H3K27me3的低水平預(yù)示著治療效果差。對于不同腫瘤而言，H3K27me3在治療中顯示出的表達上調(diào)或者下調(diào)所代表的的意義并不一致，需要結(jié)合具體作用機制綜合分析。同樣，使用H3K27me3進行預(yù)后分析時，也有相似情況。例如H3K27me3的表達缺失與乳腺癌、卵巢癌和胰腺癌患者的預(yù)后不良有關(guān)。與之相反，有研究者發(fā)現(xiàn)H3K27me3在肝細胞癌的高表達與血管浸潤密切相關(guān)，并預(yù)示患者的預(yù)后差。
此外，H3K27me3作為生物標志物在相關(guān)表現(xiàn)遺傳新藥的開發(fā)和評價中也具有重要意義。例如通過細胞的高通量篩選法，以H3K27me3為靶點從329049個化合物中鑒定出EZH2介導(dǎo)基因沉默的新藥NPD13668。在EZH2選擇性抑制劑EPZ005687對多巴胺能神經(jīng)元發(fā)育的研究中，發(fā)現(xiàn)該藥物可抑制H3K27me3并增強神經(jīng)元的分化等。在EZH2抑制劑的臨床藥物研究中，進行H3K27me3水平的檢測，是在臨床早期進行EZH2抑制劑藥理藥效研究最為重要的手段，同時該檢測結(jié)果還可為II期臨床實驗最優(yōu)藥物劑量的選擇提供重要依據(jù)。EZH2抑制劑可基于H3K27me3水平的藥效學(xué)數(shù)據(jù)，結(jié)合最大耐受藥物劑量數(shù)據(jù)，選擇合適的藥物劑量以達到最佳藥效，并降低毒副作用，助力更加精準的轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究。
參考文獻：
1. 流式細胞術(shù)-原理、操作及應(yīng)用，陳朱波、曹雪濤著，科學(xué)出版社出版。
2. Mutation of A677 in histone methyltransferase EZH2 in human B-cell lymphoma promotes hypertrimethylation of histone H3 on lysine 27 (H3K27). Michael T. McCabe, Alan P. Graves，et al.DOI:10.1073/pnas.1116418109.
3. H3K27me3在腫瘤中的研究進展，徐靜純，王 聰，南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版）。
4. CDYL promotes the chemoresistance of small cell lung cancer by regulation H3K27 trimethylation at the CDKNIC promoter[J]. QIU ZG, ZHU WL, MENG H, et al. Theranostics, 2019, 9(16):4717-4729.
5. Systematic comparison of monoclonal versus polyclonal antibodies for mapping histone modifications by CHIP-Seq[J]. BUSBY M, XUE C, LI C, et al. Epigenetics Chromation, 2016, 9:49.
6. Poster, Chromatin Flow Cytometry Based Assessment of H3K27me3 Pharmacodynamics in Blood from Diffuse Large B-Cell Lymphoma (DLBCL) and Follicular Lymphoma (FL) Patients Following Exposure to the EZH2 Inhibitor Tazemetostat Reveals Disparate Response Profiles in Specific PBMC Subpopulations.
