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前言
隨著國(guó)家藥品監(jiān)督管理局藥品審評(píng)中心正式發(fā)布《以臨床價(jià)值為導(dǎo)向的抗腫瘤藥物臨床研發(fā)指導(dǎo)原則》，中國(guó)的新藥研發(fā)邁入深水區(qū)。當(dāng)以患者為核心的臨床藥物研發(fā)開展新藥臨床試驗(yàn)設(shè)計(jì)時(shí)，對(duì)照組由普遍安慰劑變成了廣泛應(yīng)用的最佳治療方式/藥物，創(chuàng)新藥臨床研發(fā)和獲批的規(guī)則正在被深刻的改變，同時(shí)新藥物獲批難度將會(huì)進(jìn)一步增大。臨床試驗(yàn)階段，新藥是否有效？將會(huì)被新藥是否比現(xiàn)有療法/同類藥物更加有效這個(gè)問題所替代。臨床試驗(yàn)檢測(cè)過程中越早對(duì)有效性的問題進(jìn)行回答，在現(xiàn)有的政策環(huán)境下越能夠加快臨床的進(jìn)度，或者及時(shí)規(guī)避風(fēng)險(xiǎn)。使用Ex vivo試驗(yàn)用于早期臨床特別是一期臨床的藥效學(xué)評(píng)估，是新藥特別是First in class新藥常用的評(píng)估方式。筆者將從檢測(cè)原理，案例分析和熙寧生物的臨床檢測(cè)實(shí)踐三方面對(duì)Ex Vivo試驗(yàn)用于早期臨床的藥效學(xué)評(píng)估進(jìn)行論述。
Ex Vivo試驗(yàn)用于臨床檢測(cè)原理
有別于In-vitro（體外試驗(yàn)）使用的活性蛋白或者腫瘤細(xì)胞系，In-vivo（體內(nèi)試驗(yàn)）使用動(dòng)物或者人體，Ex-vivo（離體試驗(yàn)）使用的從動(dòng)物/人體取出的原代細(xì)胞/組織，采用體外試驗(yàn)的模式進(jìn)行檢測(cè)分析。
臨床Ex-vivo試驗(yàn)?zāi)Ｊ接捎谄涫褂玫牟牧蟻碜杂谟盟幒蟮娜梭w，該檢測(cè)方法相對(duì)于in-vitro試驗(yàn)來說，能夠較為真實(shí)的還原藥物在人體復(fù)雜免疫細(xì)胞互作環(huán)境下的真實(shí)表現(xiàn)，更具備生理相關(guān)性。同時(shí)，臨床Ex-vivo試驗(yàn)使用體外檢測(cè)的模式，相對(duì)于in-Vivo試驗(yàn)，試驗(yàn)周期較短，能夠更為快捷得到有參考價(jià)值的數(shù)據(jù)，特別是在臨床一期健康受試者的臨床試驗(yàn)中，基于藥物的作用機(jī)理，通過設(shè)計(jì)合適的Ex-vivo評(píng)價(jià)方案，可以獲得跟藥物作用機(jī)理緊密相關(guān)的藥效學(xué)數(shù)據(jù)。
臨床Ex-vivo試驗(yàn)多采用能夠通過較為簡(jiǎn)單方式從人體獲得的生物材料，通常為人全血，人PBMC或者人血清。使用人體的生物材料進(jìn)行檢測(cè)，樣品具備多重屬性，既包含有藥物成分，也作為檢測(cè)體系中重要構(gòu)成材料，且存在個(gè)體差異，不同采樣點(diǎn)的狀態(tài)差異等，臨床Ex-vivo試驗(yàn)的樣品采集條件控制，檢測(cè)條件控制，數(shù)據(jù)處理和解讀均較為復(fù)雜，是難度和變異系數(shù)最高的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)類型。
無論是小分子藥物，抗體類藥物，免疫調(diào)節(jié)劑類藥物，疫苗類藥物均可通過使用人全血中特定的細(xì)胞亞群或者組分，直接進(jìn)行或者作為替代標(biāo)志物進(jìn)行藥效學(xué)評(píng)估。
Ex Vivo試驗(yàn)臨床早期進(jìn)行藥效學(xué)檢測(cè)案例分析
隨著中國(guó)新藥研發(fā)進(jìn)一步加速，藥物研發(fā)模式完成了由藥物仿制到靶點(diǎn)追蹤模式的轉(zhuǎn)變，隨著監(jiān)管政策的進(jìn)一步收緊，藥物研發(fā)模式必將進(jìn)一步進(jìn)行優(yōu)化。筆者認(rèn)為后續(xù)新藥研發(fā)模式進(jìn)一步優(yōu)化，其中一個(gè)重要環(huán)節(jié)在于臨床藥物評(píng)價(jià)體系的構(gòu)建，使用Ex Vivo試驗(yàn)臨床早期進(jìn)行藥效學(xué)檢測(cè)評(píng)估將會(huì)使臨床藥物評(píng)價(jià)體系中重要一環(huán)，下面筆者通過公開的資料梳理下Ex Vivo試驗(yàn)用于早期藥效學(xué)評(píng)估的案例。
案例1：抗體藥物Zolbetuximab（anti-Claudin18.2）和cetuximab (anti-EGFR)的Ex vivo ADCC和CDC功能。
抗體藥物通過靶向腫瘤的靶點(diǎn)，介導(dǎo)機(jī)體免疫細(xì)胞和補(bǔ)體殺傷腫瘤細(xì)胞，發(fā)揮ADCC和CDC功能是靶向抗體藥物的主要的藥效學(xué)作用機(jī)理，在1期臨床中進(jìn)行Ex vivo ADCC和CDC功能學(xué)評(píng)估是預(yù)測(cè)在個(gè)體中藥物是否能夠起效的一個(gè)關(guān)鍵指標(biāo)。使用細(xì)胞殺傷模型檢測(cè)人樣品中IMAB362藥物介導(dǎo)人樣品PBMC介導(dǎo)的殺傷NUGC4的效果，報(bào)告基因方法進(jìn)行檢測(cè)。
案例2：CD28免疫激動(dòng)劑Davoceticept (ALPN-202)的Ex vivo臨床藥效學(xué)評(píng)估
使用全血共刺激模型檢測(cè)人樣品中CD28激動(dòng)劑Davoceticept藥物介導(dǎo)全血刺激后IL2的分泌，ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)。
案例3：C3補(bǔ)體抑制劑Empaveli的Ex vivo臨床藥效學(xué)評(píng)估
使用補(bǔ)體旁路活化途徑溶血模型檢測(cè)人樣品中Empaveli藥物介導(dǎo)的人樣品中血清的溶血效果。
案例4：CDK4/6抑制劑Trilaciclib的Ex vivo臨床藥效學(xué)評(píng)估
使用全血刺激模型檢測(cè)人樣品中Trilaciclib介導(dǎo)的對(duì)人樣品中全血T細(xì)胞的增殖抑制效果,流式方法進(jìn)行檢測(cè)。
案例5：RSV抗體Nirsevimab的Ex vivo臨床藥效學(xué)評(píng)估
使用RSV病毒感染模型檢測(cè)人血清樣品中Nirsevimab對(duì)RSV感染細(xì)胞的抑制中和效果，細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行檢測(cè)。
案例6：COVID-19 vaccine BNT162b1的Ex vivo臨床藥效學(xué)評(píng)估
使用COVID-19 Spike蛋白刺激PBMC模型檢測(cè)Spike蛋白R(shí)BD多肽Pool刺激人樣品中CD4+和CD8+ T細(xì)胞，檢測(cè)人樣品細(xì)胞免疫效果，ELISPOT方法進(jìn)行檢測(cè)。
案例7：IL-4Ra 抑制劑 AZD1402的Ex vivo臨床藥效學(xué)評(píng)估
使用全血刺激模型檢測(cè)人樣品中AZD1402介導(dǎo)的對(duì)人樣品中全血CD3細(xì)胞的STAT6磷酸化水平抑制效果,流式方法進(jìn)行檢測(cè)。
熙寧生物Ex Vivo試驗(yàn)實(shí)踐和難點(diǎn)考量
熙寧生物有非常豐富的小分子藥物和生物制品早期臨床的藥效學(xué)評(píng)估經(jīng)驗(yàn)，相對(duì)于傳統(tǒng)的PK藥物代謝，定量型biomarker或者免疫原性分析方法，Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)有包含全部或者部分顯著性區(qū)別和難點(diǎn)：
1.非定量型檢測(cè)。藥效學(xué)檢測(cè)的是藥物引起體內(nèi)生物材料的變化如PBMC的轉(zhuǎn)錄因子蛋白磷酸化水平變化，該變化指向的目的分子往往沒有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，無法在檢測(cè)體系中建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品檢測(cè)無法匯報(bào)具體的濃度結(jié)果。該情況引發(fā)的后果是需要通過檢測(cè)方法得到信號(hào)值變化或者均一化以后的信號(hào)值變化來對(duì)藥物引起的變化進(jìn)行表征，而在長(zhǎng)期的樣品分析過程中，信號(hào)值變化除了會(huì)受到藥物的影響，同時(shí)也會(huì)受到不同天檢測(cè)方法條件的影響，為多變量參數(shù)。因此，在進(jìn)行Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)時(shí)，維持不同天檢測(cè)方法條件的嚴(yán)格一致性，是臨床藥效學(xué)試驗(yàn)取得跟藥物有相關(guān)性結(jié)果的關(guān)鍵。
2.個(gè)體差異。Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果除了受藥物影響外，會(huì)受到來自于個(gè)體的生物材料的顯著影響，通常生物材料具備顯著的個(gè)體差異（如不同個(gè)體的PBMC在檢測(cè)體系中有不同的響應(yīng)強(qiáng)度）。該情況引發(fā)的后果是需要通過檢測(cè)單個(gè)個(gè)體的Pre-dose樣品和用藥后樣品進(jìn)行藥效學(xué)比較，可能會(huì)出現(xiàn)不同個(gè)體的藥效學(xué)結(jié)果差異較大的情況，如在A個(gè)體中藥物有效，在B個(gè)體中藥物無效。個(gè)體用藥后的藥效需要結(jié)合個(gè)體能夠引發(fā)的檢測(cè)體系的響應(yīng)強(qiáng)度綜合進(jìn)行判斷，必要時(shí)需要根據(jù)個(gè)體能夠引發(fā)的檢測(cè)體系的響應(yīng)強(qiáng)度進(jìn)行分組來分析藥物的藥效學(xué)效果。
3.樣品穩(wěn)定性。Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)的檢測(cè)樣品具備多元屬性，樣品中的藥物為檢測(cè)物質(zhì)，樣品中的生物材料如全血為檢測(cè)體系的試劑。通常情況下藥物較為穩(wěn)定，但是作為檢測(cè)試劑的生物材料并非穩(wěn)定的存在，全血在檢測(cè)體系的穩(wěn)定性通常為48-72小時(shí)以內(nèi)，個(gè)別項(xiàng)目要求24小時(shí)以內(nèi)， 甚至為8小時(shí)以內(nèi)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的考察。樣品的檢測(cè)結(jié)果由樣品的藥物濃度和樣品的生物材料活性共同決定，在進(jìn)行樣品分析時(shí)需要確保樣品的生物材料活性出于最佳的狀態(tài)，這對(duì)樣品采集，運(yùn)輸和檢測(cè)時(shí)間均有較為嚴(yán)格的要求。同時(shí)由于樣品需要較短時(shí)間內(nèi)進(jìn)行分析，會(huì)導(dǎo)致Pre-dose，用藥后各采血點(diǎn)的樣品不能同時(shí)在一個(gè)分析批進(jìn)行分析，沒有標(biāo)準(zhǔn)曲線的對(duì)分析批信號(hào)的校準(zhǔn)，將會(huì)進(jìn)一步增加檢測(cè)結(jié)果的波動(dòng)性。
4.樣品刺激體系的建立。通常情況下健康人用藥后，樣品中的藥物對(duì)樣品中的生物材料無明顯的藥效學(xué)作用，需要對(duì)樣品中的生物材料進(jìn)行刺激后，樣品中的藥物才能顯現(xiàn)出藥效學(xué)。刺激物的選擇，刺激時(shí)間的選擇，檢測(cè)目的分子和檢測(cè)平臺(tái)的選擇均需要基于藥物的作用機(jī)理，生物材料的生理學(xué)效應(yīng)進(jìn)行設(shè)計(jì)，一個(gè)類型的藥物需要一個(gè)類型的方法。在進(jìn)行Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)時(shí)樣品中生物材料的運(yùn)輸保存和刺激，將會(huì)顯著性的影響檢測(cè)結(jié)果，是整個(gè)分析方法組成的一部分。在進(jìn)行方法學(xué)開發(fā)和驗(yàn)證過程中，將藥物加入生物材料中配制為模擬樣品進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，是一個(gè)方法是否符合實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵。
5.平臺(tái)和人員熟練度。Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)時(shí)通常包括樣品的刺激和目的檢測(cè)分子檢測(cè)兩部分，樣品的刺激通常需要進(jìn)行全血，PBMC等生物材料的處理，由于該類型生物材料的個(gè)體差異和穩(wěn)定性較差，需要有較為豐富經(jīng)驗(yàn)的人員。同時(shí)不同的藥效學(xué)方法檢測(cè)平臺(tái)不一樣，可能會(huì)使用如細(xì)胞，ELISA，F(xiàn)ACS，MSD，ELISPOT等試驗(yàn)技能，一個(gè)完整的Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)需要試驗(yàn)人員兩方面能力均要有熟練度的要求，對(duì)人員和平臺(tái)的復(fù)合能力要求較高。
6.方法學(xué)驗(yàn)證和數(shù)據(jù)匯報(bào)體系設(shè)計(jì)。Ex Vivo藥效學(xué)試驗(yàn)無明確的指導(dǎo)原則，由于其非定量試驗(yàn)類型，不能完全按照PK方法的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，由于其存在個(gè)體差異，也不能完全按照免疫原性的參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證，如果設(shè)計(jì)一個(gè)合適的方法學(xué)驗(yàn)證體系來證明或者表征方法的精密度，靈敏性，特異性，穩(wěn)固性，穩(wěn)定性，基質(zhì)效應(yīng)等參數(shù)，確保能夠滿足真實(shí)樣品的檢測(cè)需求，需要基于多方面的考量。
綜上所述，Ex Vivo藥效學(xué)分析方法是難度非常大的分析方法，從方法的設(shè)計(jì)，方法學(xué)開發(fā)和方法學(xué)驗(yàn)證，對(duì)人員和平臺(tái)均需要有較高的熟練度和經(jīng)驗(yàn)需求，需要有專業(yè)化團(tuán)隊(duì)進(jìn)行完成。
基于藥物作用機(jī)理的了解和廣泛的文獻(xiàn)資料的檢索調(diào)研，熙寧生物專業(yè)化的Ex Vivo藥效學(xué)評(píng)估團(tuán)隊(duì)能夠?yàn)榭蛻舻脑缙谂R床藥物提供個(gè)性化的臨床藥效學(xué)評(píng)估解決方案，加速臨床研發(fā)進(jìn)度，助力臨床藥物研發(fā)的精細(xì)化管理，歡迎咨詢討論。
