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一、體液免疫原性中和抗體檢測方法構(gòu)架
體液免疫包含結(jié)合抗體和中和抗體檢測，相對于結(jié)合抗體檢測，中和抗體更加具備生理學意義，由于中和抗體檢測涉及到病毒，細胞等關(guān)鍵事件其方法學開發(fā)，驗證和數(shù)據(jù)解讀也會變得比較復雜。
mRNA感染性疫苗，AAV Based藥物和溶瘤病毒，均可采用中和抗體檢測方法進行體液免疫原性評估，且有著類似的技術(shù)路徑。臨床生物分析實踐過程中，通常會采用表達CMV-Luc的假病毒用來模擬基因治療藥物的病毒載體或者真實病毒，假病毒和被模擬替代的病毒有類似的衣殼蛋白或者關(guān)鍵侵染細胞的蛋白。將假病毒和待測血清樣品孵育，加入靶細胞中，如果假病毒能夠感染細胞，將會表達luciferase，加入檢測試劑后會出現(xiàn)信號值，血清未起到阻斷假病毒感染細胞的生理學作用，血清中沒有中和抗體。如果加入檢測試劑后信號值降低，則血清中存在中和抗體，血清中的中和抗體阻斷了假病毒感染細胞，通常人血清中中和抗體的強度和信號值呈負相關(guān)，通過血清樣品檢測信號值的轉(zhuǎn)化計算，可以獲得血清樣品中抗基因治療藥物的中和抗體滴度值。檢測原理和檢測體系如圖1所示：
圖1. 基因治療產(chǎn)品中和抗體檢測原理和體系
二、體液免疫原性中和抗體檢測方法難點解析
基于基因治療藥物的臨床生物分析實踐，中和抗體檢測在方法學開發(fā)和驗證過程中有以下難點和要點。
討論：
由于基因治療藥物的病毒載體通常存在預存抗體的情況，閾值并非通過試驗測定，閾值通常定義為陰性對照的一半，樣品分析通常需要進行梯度稀釋匯報滴度值，因此整個檢測體系的構(gòu)建和數(shù)據(jù)結(jié)果的解釋相對常規(guī)免疫原性檢測會更復雜，需要有健全的方法學驗證和數(shù)據(jù)匯報體系。
臨床樣品中的血清通常含有促進病毒（如AAV2/8/9）感染細胞的作用，如圖2所示，在人血清體系中比在培養(yǎng)基體系，AAV2的感染效率提高了5-10倍。在檢測體系中人血清的基質(zhì)成分會導致信號的增加，人血清中的中和抗體會導致信號的減少，檢測方法中存在兩個拮抗的變量可能會導致檢測結(jié)果失真，特別是樣品進行梯度稀釋時，人血清的比例會逐漸減少，促進作用逐漸減弱血清梯度稀釋造成的不均一的基質(zhì)影響，會導致檢測結(jié)果的失真以及數(shù)據(jù)解讀困難。由于預存抗體的存在，常規(guī)PK方法中使用一定比例人血清稀釋液進行樣品稀釋的手段也會遇到問題，需要有較為精妙的設(shè)計來排除人血清的干擾。
圖2. 人血清極大提高了AAV2的轉(zhuǎn)染效率
三、體液免疫原性中和抗體檢測方法要點解析
1.
中和抗體檢測滴度值通常會作為AAV Based療法病人入組篩查的標準，如圖3所示，展現(xiàn)了部分上市基因治療產(chǎn)品和國內(nèi)基因治療產(chǎn)品的入排標準。就中和抗體的方法學而言，中和抗體分析方法受到試驗體系如加入的細胞量，病毒量，MOI，病毒感染細胞時間不一樣的影響，方法的靈敏度會不一樣，通常不同試驗室方法的可比性和一致性較差?？赡軙霈F(xiàn)同一樣品在不同實驗室中進行檢測，得到較大差異滴度值的情形。中和抗體檢測滴度值作為入組篩選標準需要謹慎進行調(diào)研考察，需基于方法學的檢測數(shù)據(jù)進行評估選擇。
圖3. 部分AAV藥物體液免疫抗體滴度入組
篩查標準
2.
應選擇合適的中和抗體滴度值作為入組排除標準。中和抗體滴度值標準選擇過低，可能使藥物上市后獲益人群較少，中和抗體滴度值標準選擇過高，中和抗體可能會影響到藥物在人體的有效性和安全性，藥物臨床的成功率會受到影響。根據(jù)文獻記載，不同地域人群中AAV預存抗體的比例和強度均會不同，同時不同血清型的AAV其預存抗體的比例和強度也會不一樣，針對不同血清型的AAV載體需要基于當前方法學中健康人群的AAV預存抗體的比例和強度進行合適的稀釋倍數(shù)設(shè)計和樣品分析，以及基于當?shù)亟】等巳后w中的中和抗體滴度來選擇合適的中和抗體滴度值作為入組排除標準。熙寧實驗室對同一批健康人血清進行了AAV2和AAV8的中和抗體滴度檢測，部分檢測結(jié)果如圖4。值得注意的是在AAV8滴度值小于5的健康個體中，其AAV2的滴度值均小于500，暗示著機體對不同血清型AAV之間可能存在交叉免疫的情況出現(xiàn)。
圖4. AAV預存抗體強度和健康群體比例
四、總結(jié)
中和抗體檢測是體液免疫檢測的重要一環(huán)，對于以病毒為載體的基因治療藥物，特別是以AAV為載體，機體預存的中和抗體是影響基因治療藥物有效性和安全性的關(guān)鍵因素。在病人入組篩選時，中和抗體滴度作為入組篩查的標準，甚至會影響到藥物的臨床藥效評估，以及未來上市后的市場范圍。
以假病毒感染細胞作為檢測模型的中和抗體檢測方法在臨床檢測過程中，血清的基質(zhì)干擾是方法學難點，血清基質(zhì)的存在會促進病毒感染細胞，同時血清中的中和抗體會抑制病毒感染細胞，在一個檢測方法中同時存在兩個拮抗的變量時，檢測結(jié)果的準確性和一致性是很難保證的，熙寧生物基于巧妙的試驗設(shè)計，將個體血清對檢測體系的干擾進行了排除，使檢測方法能夠單一變量反應中和抗體滴度的強弱。經(jīng)熙寧生物進行了充分驗證的方法能夠真實準確的進行血清樣品的中和抗體滴度檢測。
同時熙寧生物有較為廣闊的人健康群體基質(zhì)庫，對不同血清型AAV在人群中中和抗體滴度強度和分布比例有極為清晰的認知，能夠和客戶共同協(xié)作進行病人入組中和抗體滴度閾值確認的工作，助力AAV基因治療藥物的臨床研發(fā)。
基因治療作為熱門的新興療法，近些年發(fā)展迅速。同時，基因治療藥物研發(fā)需求多樣化、技術(shù)復雜度高的特點，也對檢測分析帶來巨大挑戰(zhàn)。熙寧生物搭建了基于基因治療藥物檢測需求的基因檢測平臺、細胞/病毒檢測平臺、流式檢測平臺和免疫檢測平臺等，能夠滿足研發(fā)項目在不同階段的在生物分析需求。團隊專注于GCT領(lǐng)域，積累了豐富的實戰(zhàn)經(jīng)驗和專業(yè)的技術(shù)服務能力，通過qPCR/ddPCR技術(shù)、細胞法中和抗體檢測技術(shù)、ELISPOT細胞免疫原性檢測技術(shù)、流式檢測技術(shù)、ELISA/MSD檢測技術(shù)等多平臺技術(shù)互聯(lián)，打通技術(shù)隔閡，真正實現(xiàn)“一個臨床/項目，一個生物分析實驗室，一個技術(shù)項目團隊”的服務方式，為基因治療產(chǎn)品生物分析提供完整解決方案。
