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前言
多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是一種危及生命且高度異質(zhì)性的疾病，發(fā)病率在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中排名第二位，目前仍無(wú)法治愈。臨床上常通過(guò)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)（multiparameter flow cytometry，MFC）可識(shí)別漿細(xì)胞異?？乖磉_(dá)并精確判斷其克隆性，常用于多發(fā)性骨髓瘤（MM）微小殘留?。∕RD）的檢測(cè)，以評(píng)價(jià)治療的有效性并預(yù)測(cè)預(yù)后。近年來(lái)，盡管在化療、蛋白酶體抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑利沙度胺衍生物、CD38靶向抗體方面取得了很大進(jìn)展，但幾乎所有患者終將復(fù)發(fā)，其根源是存在MRD，因此檢測(cè)MRD對(duì)于判斷療效、指導(dǎo)治療及預(yù)測(cè)預(yù)后有著重要意義。
MRD檢測(cè)一般流程
目前國(guó)內(nèi)MM-MRD常用8-10色抗體組合行胞膜和胞質(zhì)抗原檢測(cè)，歐洲流式學(xué)會(huì)建議應(yīng)用2管8色抗體組合的二代流式細(xì)胞術(shù)（Next generation flow cytometry，NGF），但在我國(guó)還不能普遍應(yīng)用。我們?cè)谌粘９ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)，初診MM患者高表達(dá)CD38和CD138，異常表達(dá)CD45、CD19、CD20、CD56、CD81和CD117等胞膜抗原，限制性表達(dá)胞質(zhì)輕鏈cKappa（cκ）或cLambda（cλ）。
下面介紹通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MM MRD一般流程
（1）樣本采集
骨髓（BM，優(yōu)選）或外周血（PB）
EDTA（優(yōu)選）或肝素鈉抗凝，3-5ml
運(yùn)輸存儲(chǔ)條件：4-8℃，48h之內(nèi)檢測(cè)。
（2）樣本制備
先裂紅再染色，或先染色再裂解，都是可以的。如果樣本細(xì)胞密度低，為了收集到足夠的細(xì)胞數(shù)量，建議用前一種方法，但裂解液需注意，要用無(wú)固定劑的氯化銨裂解液。對(duì)于胞質(zhì)抗體需要事先用1×PBS至少洗滌三次，破膜處理后再加入胞質(zhì)抗體。密度梯度離心不建議，這樣容易導(dǎo)致漿細(xì)胞丟失，ficoll會(huì)加速漿細(xì)胞表面CD38和CD138的丟失。
（3）設(shè)門分析
建立CD38/Time參數(shù)圖，選擇液流穩(wěn)定區(qū)域，接著利用FSC-A/FSC-H去除非特異和黏連體，最后通過(guò)CD38/CD138和/或CD38/CD45進(jìn)行設(shè)門，圈出漿細(xì)胞，通過(guò)其他抗原即可進(jìn)一步圈出正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞群體，最終通過(guò)cKappa/cLambda比值確定漿細(xì)胞的克隆性。
（4）MRD結(jié)果判斷
絕大多數(shù)正常漿細(xì)胞表型為CD38++CD138+CD45+CD19+（>75%）CD27+CD56-CD81+CD117-，非限制性表達(dá)輕鏈cKappa或cLambda（cyk或cyλ）；異常漿細(xì)胞免疫表型會(huì)出現(xiàn)CD45、CD19、CD27、CD38、CD81的異常低表達(dá)或不表達(dá)，以及CD56、CD117的異常表達(dá)，且限制性表達(dá)輕鏈cKappa或cLambda（cyk或cyλ）。
正常漿細(xì)胞和異常漿細(xì)胞相關(guān)抗原表達(dá)
案例展示
病例一，流式二維散點(diǎn)圖如下
這是一個(gè)通過(guò)CD38單抗治療后的病例，通過(guò)流式二維散點(diǎn)圖分析發(fā)現(xiàn)該病例的MRD結(jié)果陽(yáng)性，異常細(xì)胞（圖示紅色）免疫表型為CD45-CD38-CD138+CD19-CD56-CD27part，輕鏈cLambda呈限制性表達(dá)。通過(guò)CD38單抗的靶點(diǎn)治療，MRD仍然陽(yáng)性，但此時(shí)的CD38靶點(diǎn)已經(jīng)消失，后續(xù)監(jiān)測(cè)不能用CD38作為設(shè)門抗體。
病例二，流式二維散點(diǎn)圖如下
通過(guò)流式二維散點(diǎn)圖分析發(fā)現(xiàn)該病例MRD結(jié)果陽(yáng)性，異常細(xì)胞（圖示紅色）免疫表型為CD45-CD38-CD138+CD56+CD27-BCMApart，輕鏈cKappa呈限制性表達(dá)，同樣將CD38作為靶點(diǎn)治療，治療一段時(shí)間后，該靶點(diǎn)消失，MRD仍然陽(yáng)性，后續(xù)監(jiān)測(cè)不能用CD38作為設(shè)門抗體。
病例三，MM初診病例，流式二維散點(diǎn)圖如下
根據(jù)流式二維散點(diǎn)圖分析，異常細(xì)胞（圖示紅色）初診免疫表型為CD45-CD38++CD19-CD56++CD27-BCMA+（dim），輕鏈cKappa呈限制性表達(dá)，后續(xù)治療后可以通過(guò)上述表型進(jìn)行MRD監(jiān)測(cè)。
病例四，表型異常的多克隆漿細(xì)胞，流式二維散點(diǎn)圖如下
紅色細(xì)胞群免疫表型CD45-CD19-CD38++CD138+CD27+CD56+，輕鏈cKappa、cLambda呈多克隆表達(dá)。
治療進(jìn)展
CAR-T技術(shù)在目前備受關(guān)注，CAR-T治療已經(jīng)在血液惡性腫瘤治療中取得了長(zhǎng)期的臨床療效和成功的商業(yè)轉(zhuǎn)化。當(dāng)前最熱門的靶點(diǎn)仍然是CD19，但在漿細(xì)胞腫瘤上CD19的表達(dá)比較少，因此將BCMA作為聯(lián)合治療的靶點(diǎn)發(fā)揮出了它的潛力。B細(xì)胞成熟抗原BCMA（又叫CD269，也叫TNFRSF17，TNF配體超家族成員）是腫瘤壞死因子受體超家庭的成員，主要在漿細(xì)胞和成熟B細(xì)胞中表達(dá)，在多發(fā)性骨髓瘤（MM）的增殖、存活和腫瘤進(jìn)展中起著至關(guān)重要的作用。目前處在臨床前和臨床階段的靶向BCMA的MM療法主要包括抗體藥物偶聯(lián)物、雙特異性抗體和嵌合抗原受體T細(xì)胞免疫療法。
BCMA-targeted immunotherapies
結(jié)語(yǔ)
隨著靶向治療的日趨發(fā)展，在MM的免疫分型和MRD檢測(cè)中，對(duì)于作為靶點(diǎn)的標(biāo)記，在方案設(shè)計(jì)中應(yīng)將該靶點(diǎn)抗體加入對(duì)于臨床評(píng)估、診斷、治療十分有必要，同時(shí)需要注意例如CD38作為靶點(diǎn)，會(huì)導(dǎo)致某些復(fù)發(fā)的病人CD38轉(zhuǎn)陰，所以在設(shè)門的時(shí)候需要格外關(guān)注，必要的時(shí)候采用一些其他抗原進(jìn)行輔助設(shè)門可以更準(zhǔn)確的進(jìn)行監(jiān)測(cè)。
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