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免疫治療是一種激活體內免疫系統的腫瘤治療方法，在當前腫瘤治療領域起著非常重要的作用。其通過多種手段作用于腫瘤微環(huán)境中的各種組分，如靶向CTLA4、PD-1的免疫檢查點抑制劑[1]，或者改造相關免疫細胞增強其殺傷能力的細胞免疫療法，包括CAR-T,CAT-NK以及CAR-macrophage等[2]，或者來自于腫瘤細胞的新生抗原或相關抗原的腫瘤疫苗[3]以及通過調控免疫應答的細胞因子療法[4]等。在腫瘤的免疫治療領域，深入探索腫瘤微環(huán)境的動態(tài)變化對于了解免疫治療藥物的作用機制以及耐藥機制，尋找新的預測性或預后生物標記物，探索新的藥物靶點等有著重大的意義。
PART 01
腫瘤微環(huán)境
腫瘤微環(huán)境（TME）是一種非常復雜且動態(tài)變化的生態(tài)系統，除了腫瘤細胞外，其中還包含著豐富多樣的免疫細胞、癌癥相關成纖維細胞 (CAF)、內皮細胞 (EC)、周細胞以及因組織而異的其他細胞類型。不同細胞通過不同的作用機制發(fā)揮相應的作用。根據各種細胞腫瘤微環(huán)境中的主要功能可將這些細胞分為腫瘤細胞、免疫細胞和支持細胞三大類。這些細胞之間相互作用，形成了功能復雜的腫瘤微環(huán)境[5]。
圖1 腫瘤微環(huán)境中的組分與狀態(tài)
如圖1所示，在腫瘤微環(huán)境中存在多種免疫浸潤細胞，主要分為T細胞、B細胞、NK細胞、巨噬細胞等。腫瘤免疫治療主要就是通過增強相關免疫細胞的功能，解除免疫微環(huán)境內的免疫檢查點抑制路徑或消減腫瘤抑制免疫細胞數量等多種方式達到治療腫瘤的效果[6]。
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CD8+ T細胞是抗腫瘤免疫應答的核心，是在抗腫瘤過程中發(fā)揮強大作用的效應細胞，通常在活化后分化為細胞毒性T細胞（CTL），能夠特異性地殺傷靶細胞。通常腫瘤內的CD8+T細胞具有功能耗盡或免疫抑制的特點，免疫檢查點抑制劑旨在通過解除這種抑制從而發(fā)揮作用；
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調節(jié)性T細胞（Treg）主要以FoxP3為主要標志物，在腫瘤微環(huán)境中會減弱T細胞的活性，促進腫瘤微環(huán)境的免疫抑制，起到一個剎車的效果；
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巨噬細胞以CD68為主要標記物，主要分為兩種，即M1型巨噬細胞和M2型巨噬細胞。M1型巨噬細胞發(fā)揮促炎和抗瘤作用，但TME中的腫瘤相關巨噬細胞（TAM）為M2型，通過分泌IL-10、VEGF、精氨酸酶、金屬基質蛋白酶等促進血管生成和腫瘤侵襲；
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NK細胞的主要標記物是CD56，會釋放顆粒酶和穿孔素殺傷靶細胞，但在TME中富集的TGF-β會抑制其殺傷活性；
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B細胞的主要標記物為CD20，是體液免疫的關鍵介質，可以駐留在腫瘤內三級淋巴結構 (TLS) 中，通過抗原呈遞促進T細胞激活；
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腫瘤相關成纖維細胞（CAFs）主要分布于血管周圍或腫瘤外周纖維間質內，分泌細胞因子、ECM成分及相關酶分子，是TGF-beta的主要來源，能夠抑制腫瘤中的大多數免疫細胞，促進腫瘤的增值和轉移。
PART 02
mIHC技術與腫瘤免疫微環(huán)境
鑒于腫瘤微環(huán)境中腫瘤細胞、免疫細胞、支持細胞間復雜的相互作用，在免疫治療相關藥物的開發(fā)中搞清楚腫瘤微環(huán)境的狀況和變化趨勢，對于理解藥物的作用機理，尋找潛在的預測性指標，開發(fā)新的藥物靶點等各方面非常重要。mIHC技術可以在一張組織切片上同時檢測多種標記物，進而通過圖像分析軟件獲得各種標記物的數量、組合、空間分布等信息，直觀高效地對腫瘤微環(huán)境進行觀察和分析，這些是其他技術手段不具備的直觀信息，對于腫瘤微環(huán)境的研究起著不可替代的重要作用。
優(yōu)勢1 ：mIHC技術與金標準方法的一致性高
隨著mIHC技術的發(fā)展，相關的技術手段也越來越成熟，與普通單標免疫組化技術的一致性較高，在不同機構間的重復性也較好，這些都使得其結果的可信度大大提升，進一步拓展了應用的場景。
一項研究[3]顯示，通過常規(guī)IHC、單色IF和mIHC三種染色方法，對每種標記表型為“陽性”的細胞百分比進行定量比較。對于每個標志物，每個樣本（n=5 個 NSCLC 檔案樣本）獲取 10 個 HPF，并對陽性細胞百分比進行平均。結果顯示：DAB顯色常規(guī)IHC 、單色IF和mIHC相比，每個標記物的陽性細胞百分比證明了所有三種染色方式的等效性。
圖2 mIHC技術與金標準方法的一致性
優(yōu)勢2 ： mIHC技術在不同機構間的一致性高
在一項多機構的多重免疫熒光重復性評估（MITRE）研究[3]中，6家研究機構使用了mIHC技術方案，來驗證基于腫瘤組織樣本中的PD-1/PD-L1表達結果的一致性。結果表明: 在IC密度、表達方面，室間一致性很高。
圖3 mIHC技術在不同機構間的一致性
總之，mIHC技術作為新興的腫瘤免疫微環(huán)境研究的主要工具，能夠準確，穩(wěn)定，直觀地反應免疫微環(huán)境的動態(tài)變化，在腫瘤微環(huán)境的研究中發(fā)揮了越來越重要的作用，是腫瘤微環(huán)境研究不可或缺的利器。
PART 03
熙寧生物｜精翰生物mIHC平臺簡介
熙寧生物｜精翰生物組織病理實驗室mIHC平臺配備了高標準的徠卡Bond Rx全自動免疫組化染色機、Akoya PhenoImager全光譜成像系統以及Halo數字病理圖像分析平臺等重量級設備及分析系統，可提供自動化、高質量的mIHC研究全流程解決方案，從panel設計，panel驗證，以及樣本檢測等提供全方位的支持，可為廣大藥企朋友提供高品質的臨床前、臨床試驗階段的組織樣本mIHC檢測。
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參考文獻：
[1] Alsaab, Hashem O et al. “PD-1 and PD-L1 Checkpoint Signaling Inhibition for Cancer Immunotherapy: Mechanism, Combinations, and Clinical Outcome.” Frontiers in pharmacology vol. 8 561. 23 Aug. 2017, doi:10.3389/fphar.2017.00561
[2] Pan, Kevin et al. “CAR race to cancer immunotherapy: from CAR T, CAR NK to CAR macrophage therapy.” Journal of experimental & clinical cancer research : CR vol. 41,1 119. 31 Mar. 2022, doi:10.1186/s13046-022-02327-z
[3] Giarelli, Ellen. “Cancer vaccines: a new frontier in prevention and treatment.” Oncology (Williston Park, N.Y.) vol. 21,11
[4] Zheng, Xiaohu et al. “The use of supercytokines, immunocytokines, engager cytokines, and other synthetic cytokines in immunotherapy.” Cellular & molecular immunology vol. 19,2 (2022): 192-209. doi:10.1038/s41423-021-00786-6
[5] de Visser, Karin E, and Johanna A Joyce. “The evolving tumor microenvironment: From cancer initiation to metastatic outgrowth.” Cancer cell vol. 41,3 (2023): 374-403. doi:10.1016/j.ccell.2023.02.016
[6] Pi?eiro Fernández, Julián et al. “Hepatic Tumor Microenvironments and Effects on NK Cell Phenotype and Function.” International journal of molecular sciences vol. 20,17 4131. 24 Aug. 2019, doi:10.3390/ijms20174131
[7] Taube, Janis M et al. “Multi-institutional TSA-amplified Multiplexed Immunofluorescence Reproducibility Evaluation (MITRE) Study.” Journal for immunotherapy of cancer vol. 9,7 (2021): e002197. doi:10.1136/jitc-2020-002197
