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呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾病（Acute Lower Respiratory Tract Infections，ALRTIs）的主要病原體之一，具有高度傳染性和致病性，嚴重時會導致患者支氣管炎、肺炎和哮喘的發(fā)生，給家庭造成了嚴重的疾病和經(jīng)濟負擔。
RSV分為A和B兩種亞型，不同亞型又包括多種基因型，在流行季節(jié)，不同基因型可同時傳播，其高傳染性及致死率亟需有效的預防和治療手段。目前，多條路線制備的RSV疫苗正處于臨床發(fā)展的不同階段，其中2家已獲批上市，分別為GSK的Arexvy和輝瑞的Abrysvo，均為Pre-F重組蛋白疫苗，以及Moderna MRESVIA，為mRNA疫苗。Moderna mRNA-1345也處于上市申請階段，為mRNA疫苗。此外，預防性的單克隆抗體Palivizumab和Nirsevimab分別獲批上市，用于預防新生兒和嬰兒由RSV引起的下呼吸道感染。
疫苗開發(fā)的關鍵是能夠衡量其有效性，隨著越來越多的RSV疫苗和預防性藥物獲批上市和進入臨床階段，RSV產(chǎn)品的臨床評價方法變得越來越重要，這主要包括中和抗體、結合抗體、病毒載量以及細胞免疫等方面的內(nèi)容。
PART 01
RSV中和抗體檢測
RSV疫苗和預防性藥物旨在誘導強大的RSV病毒中和免疫反應，Palivizumab和Nirsevimab證明RSV中和抗體可針對 RSV引起的嚴重下呼吸道疾病提供被動保護，驗證了RSV中和抗體與預防保護的相關性。WHO也支持使用RSV中和抗體檢測作為評估RSV疫苗免疫原性的初步方法，即作為RSV預防保護性的主要血清學標志。然而，目前全球有多種不同的RSV中和抗體檢測方法，開發(fā)出一種準確、高通量的RSV中和抗體檢測方法，對于RSV產(chǎn)品臨床標準化以及評估新型RSV疫苗候選物都具有重要意義，不僅有助于提高RSV產(chǎn)品研發(fā)的效率，而且對于全球范圍內(nèi)的RSV疫苗和預防藥物的臨床效果評估和對比也至關重要。
傳統(tǒng)的中和抗體檢測方法為噬斑減少中和試驗（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）和微量細胞中和試驗，此外，基于ELISA、ELISpot等技術的中和抗體檢測方法，可通過針對病毒蛋白的抗體對感染細胞中病毒蛋白進行檢測，具有簡單、快速、高通量和高度敏感性等優(yōu)勢，且在多種RSV疫苗和預防性藥物的中和抗體檢測中均有適用。如圖1所示，不同RSV中和抗體檢測在檢測方法、病毒、細胞、顯色模式、檢測時長、通量等方面有所不同。圖2為不同RSV疫苗和預防性藥物臨床試驗使用的中和抗體檢測方法。
圖1 RSV中和抗體檢測方法
圖2 RSV疫苗和預防性藥物臨床試驗中和抗體檢測方法
噬斑減少中和試驗（PRNT）
PRNT指的是適當稀釋的血清與病毒中和后，感染細胞對形成的空斑進行定量測定的方法。盡管該方法在多種病毒中能反映出中和抗體對病毒感染宿主細胞的病理影響，但具有周期長，操作條件要求高，成本高及通量低等不足之處。
微量細胞中和試驗（CPE）
微量細胞中和試驗指的是連續(xù)稀釋的病毒與血清中和后，感染細胞，根據(jù)是否存在細胞病變效應(Cytopathic Effect，CPE)進行定量測定的方法。但該方法檢測周期較長，且不同的實驗人員對于細胞病變的判定標準不同，這在很大程度上會造成不可避免的人為誤差。
微孔病毒中和試驗，檢測病毒蛋白含量
基于ELISA或ELISpot的中和抗體檢測方法，可通過針對病毒蛋白的抗體對感染細胞中病毒蛋白進行檢測，具有高度敏感性和可重復性，且在多種病毒中和抗體檢測中均可適用，如RSV、流感病毒、SARS-CoV-2等。
如圖3所示，RSV中和抗體和RSV病毒預先孵育，然后加入HEp-2細胞再進行一定時間的孵育，通過ELISA方法檢測RSV抗原含量來反映中和抗體的中和病毒效果。
圖3 RSV微孔病毒中和后檢測病毒蛋白含量
病毒報告基因中和試驗
該方法為基于RSV-GFP/Luciferase重組病毒的微量細胞中和試驗法，將一定濃度的樣本、RSV中和抗體與含報告基因（GFP/Luciferase）的RSV病毒預先孵育，然后加入HEp-2細胞再進行一定時間的孵育，通過檢測細胞的熒光信號或者luciferase的表達來反映中和抗體的中和病毒效果。
圖4 RSV病毒報告基因中和試驗
PART 02
小結
熙寧生物|精翰生物以分析科學為核心能力，為新藥臨床與臨床前研究提供專業(yè)技術服務。在疫苗臨床研究領域，我們擁有完善的檢測平臺和一站式檢測服務能力，開發(fā)了基于ELISA、Fluorescence、Luminescence高通量的中和抗體評估方法，具有基于ELISpot、ICS的細胞免疫檢測能力，支持中美、中澳、多中心、大樣本量的臨床試驗，有著豐富的海外樣品進口經(jīng)驗。
熙寧生物|精翰生物在RSV臨床研究領域的項目檢測經(jīng)驗非常豐富，可提供一體化、高效率的臨床生物分析服務，包括：
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微孔病毒中和法進行血清中RSV-A和RSV-B中和抗體滴度檢測；
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ELISA/MSD方法進行血清中RSV 抗F蛋白的特異性抗體濃度檢測；
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RT-qPCR方法進行RSV病毒載量檢測；
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ELISPOT和ICS方法進行RSV抗原多肽特異性T細胞反應檢測；
熙寧生物|精翰生物可高效助力RSV疫苗和藥物領域臨床研究的開展，歡迎大家后臺留言咨詢交流。
參考文獻：
[1] 疫苗臨床試驗抗體分析方法研究技術指導原則
[2] Development of a High-Throughput Respiratory Syncytial Virus Fluorescent Focus-Based Microneutralization Assay
[3] RSV neutralization assays – Use in immune response assessment
[4] Expansion of the 1st WHO international standard for antiserum to respiratory syncytial virus to include neutralisation titres against RSV subtype B An international collaborative study
[5] An Improved and High Throughput Respiratory Syncytial Virus (RSV) Micro-neutralization Assay
