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呼吸道合胞病毒（Respiratory Syncytial Virus，RSV）是全球范圍內(nèi)引起嬰幼兒、免疫缺陷人群及老年人急性下呼吸道疾病（Acute Lower Respiratory Tract Infections，ALRTIs）的主要病原體之一，具有高度傳染性和致病性，嚴(yán)重時會導(dǎo)致患者支氣管炎、肺炎和哮喘的發(fā)生，給家庭造成了嚴(yán)重的疾病和經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。
研發(fā)有效的RSV疫苗成為預(yù)防RSV感染的重要手段之一，此前數(shù)十年間，科學(xué)家們不曾停止對于RSV疫苗的研究與開發(fā)，但均以失敗告終。2023年，F(xiàn)DA相繼批準(zhǔn)了葛蘭素史克（GSK）的Arexvy和輝瑞（Pfizer）的Abrysvo兩款RSV疫苗，用于預(yù)防60歲及以上人群中由呼吸道合胞病毒（RSV）引起的下呼吸道疾病，實現(xiàn)了RSV疫苗和藥物開發(fā)領(lǐng)域近60年來里程碑式的突破。
PART 01
Pre-F蛋白為RSV疫苗研發(fā)的關(guān)鍵抗原
關(guān)鍵抗原的選擇是RSV疫苗研發(fā)成功的關(guān)鍵，F(xiàn)蛋白和G蛋白對RSV病毒的黏附和入侵十分重要，也是病毒表面的主要保護(hù)性抗原，二者都可以成為RSV研發(fā)的理想靶點。然而由于G蛋白變異較多相對不穩(wěn)定，基于Pre?F蛋白的RSV疫苗具有較高的安全性和免疫原性，適用于兒童、孕婦、成人和老年人群。
F蛋白具有黏附和融合功能，可介導(dǎo)病毒粒子進(jìn)入細(xì)胞，形成合胞體。在RSV感染過程中，F(xiàn) 蛋白首先采用亞穩(wěn)態(tài)的融合前F 蛋白（ Pre-fusion Protein，Pre-F） 表達(dá)在病毒包膜表面，當(dāng)與宿主細(xì)胞膜接觸后，結(jié)構(gòu)重排為高度穩(wěn)定的融合后F 蛋白（ Post-fusion Protein，Post-F），存在Pre-F和Post-F構(gòu)象變化。
圖1 RSV Pre-F和Post-F蛋白結(jié)構(gòu)和抗原位點[1]
Pre?F蛋白具備6 種抗原表位，即SiteⅠ、II、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、?，而Post?F僅包含Pre?F的前4種表位。研究表明，可誘導(dǎo)更強中和抗體活性的抗原表位Site Ⅴ和Site ?均位于Pre?F蛋白中，尤其是Site ?誘導(dǎo)的中和抗體活性最高（位于Pre?F頂端）。因此，誘導(dǎo)高滴度的中和抗體是開發(fā)RSV疫苗的主要目標(biāo)，血清中大多數(shù)RSV中和活性僅針對Pre?F抗原位點，具有特異性抗原表位的Pre?F蛋白則成為最熱門的RSV疫苗靶標(biāo)。
PART 02
RSV疫苗臨床進(jìn)展
RSV疫苗的開發(fā)始于1957年首次在人類中發(fā)現(xiàn)RSV病毒后不久。1960年代便開發(fā)了FI-RSV疫苗，并在嬰兒身上進(jìn)行了臨床試驗。疫苗病毒通過細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生，用福爾馬林滅活，并與明礬混合作為佐劑。然而，F(xiàn)I-RSV主要表達(dá)Post-F構(gòu)象而非Pre-F構(gòu)象，該疫苗不僅未能保護(hù)血清陰性的嬰兒免受RSV的侵害，還誘發(fā)嚴(yán)重的增強型呼吸道疾?。‥nhanced Respiratory Disease，ERD），導(dǎo)致80%的受試嬰兒住院治療，并導(dǎo)致2人死亡。ERD的部分原因為福爾馬林導(dǎo)致疫苗制劑中和表位的破壞，F(xiàn)I-RSV注射可導(dǎo)致免疫紊亂，表現(xiàn)為CD4+T細(xì)胞數(shù)量和Th2細(xì)胞因子水平增加，同時，CD8+T細(xì)胞數(shù)量和Th1細(xì)胞因子水平降低，可能也有助于ERD。因此，在血清陰性兒童中開發(fā)滅活疫苗和蛋白質(zhì)疫苗時，必須考慮ERD發(fā)展的潛在風(fēng)險?；诖擞绊懀琑SV疫苗的開發(fā)推遲了幾十年，目前有五種類型的RSV疫苗正在開發(fā)中，即基于顆粒的、基于載體的、減毒活疫苗或嵌合疫苗、亞單位疫苗和mRNA疫苗。
圖2 RSV免疫策略[2]
圖3 RSV疫苗臨床進(jìn)展[2]
Arexvy
2023年5月4日，F(xiàn)DA批準(zhǔn)葛蘭素史克公司的RSV疫苗Arexvy上市，用于預(yù)防60歲及以上人群因感染RSV引發(fā)的下呼吸道疾?。↙RTD），這是全球首款獲批用于老年人的RSV疫苗，Arexvy由穩(wěn)定的pre-F與AS01佐劑組成。
基于AReSVi-006關(guān)鍵性III期試驗結(jié)果，Arexvy對60歲及以上成人的RSV-LRTD的保護(hù)效力為82.6%，具有顯著的統(tǒng)計學(xué)和臨床意義，達(dá)到試驗主要終點。在至少患有一種基礎(chǔ)疾?。ㄈ缧难芗膊『蛢?nèi)分泌代謝疾?。┑睦夏耆酥?，該疫苗的保護(hù)力為94.6%。對于重度RSV-LRTD患者（即因RSV-LRTD妨礙日?；顒拥幕颊撸浔Ｗo(hù)效力為94.1%。
Abrysvo
2023年6月1日，輝瑞宣布其RSV二價疫苗Abrysvo獲得FDA批準(zhǔn)，用于預(yù)防60歲及以上成人由RSV引起的LRTD。該疫苗是一種非佐劑二價疫苗，含有來自RSV-A和RSV-B的穩(wěn)定pre-F蛋白亞基。
Abrysvo III期臨床試驗RENOIR數(shù)據(jù)顯示，Abrysvo在預(yù)防至少有兩種癥狀的RSV-LRTD方面的有效率為66.7%，在預(yù)防有三種或以上癥狀感染方面的有效率為85.7%。此外，這項研究還表明，針對融合前形式蛋白的特異性抗體在阻斷病毒感染方面非常有效，這表明基于Pre-F蛋白的疫苗可能對RSV起到最佳保護(hù)作用。
除60歲及以上人群外，新生兒同樣為弱勢群體，Abrysvo開發(fā)了另一個適應(yīng)癥：通過孕婦的主動免疫預(yù)防剛出生至6個月大的嬰兒中由RSV引起的下呼吸道疾病和嚴(yán)重下呼吸道疾病。即通過給孕婦注射疫苗，降低新生嬰兒的感染風(fēng)險，此前，F(xiàn)DA已批準(zhǔn)了Abrysvo的BLA優(yōu)先審評。
圖4 Abrysvo疫苗母體和嬰兒血清中RSV-A、RSV-B中和抗體滴度檢測[4]
2024年4月9日，輝瑞宣布其研究開發(fā)的RSV疫苗（ Abrysvo） 的一項III期臨床研究獲得積極結(jié)果，透露出Abrysvo將有望用于18~59歲的成人因呼吸道合胞病毒引起的下呼吸道疾?。≧SV-LRTD）的積極信號，有望成為全球首款針對18歲及以上成年人的RSV疫苗。
mRNA疫苗
mRNA可以通過設(shè)計編碼序列來編碼穩(wěn)定的F蛋白構(gòu)象，編碼天然RSV F蛋白或穩(wěn)定的Pre-F構(gòu)象的mRNA疫苗也通過使用陽離子納米顆粒和LNP成功遞送。莫德納開發(fā)并正在評估三種編碼pre-F蛋白的單劑量候選疫苗，即用于成人的mRNA-1172和mRNA-1777，以及用于兒童的mRNA-1345。
圖5 RSV mRNA疫苗臨床進(jìn)展[1]
mRNA-1777（V171）疫苗包含經(jīng)化學(xué)修飾RSV pre-F的mRNA和使用了與莫德納COVID-19 mRNA疫苗相同的脂質(zhì)納米粒（LNP）。臨床I期研究在72名健康的年輕人（≥18歲，≤49歲）和107名健康的老年人（年≤60歲，≤79歲）中進(jìn)行，參與者接受25，100，200或300 μg mRNA-1777（V171）或安慰劑作為單一肌肉注射劑量，主要目標(biāo)是評估安全性和耐受性，次要目標(biāo)評估體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫原性。結(jié)果顯示，所有劑量水平的mRNA-1777（V171）耐受性良好，未報告與疫苗相關(guān)的嚴(yán)重不良事件。
通過血清RSV A、RSV B中和抗體滴度，血清RSV Pre-F蛋白抗體滴度，血清RSV Pre-F蛋白D25競爭性抗體滴度等檢測，mRNA-1777疫苗可引起有效的體液免疫應(yīng)答。通過FACS和ELISPOT檢測細(xì)胞對RSV-F多肽的免疫反應(yīng)，與mRNA-1777疫苗RSV-F蛋白相關(guān)的T細(xì)胞反應(yīng)也有所增加，并且主要與CD4+ T細(xì)胞亞群相關(guān)。
圖6 mRNA-1777 （V171）疫苗特異性T細(xì)胞反應(yīng)（IFN-γ ELISPOT檢測，A 年輕人，B老年人）[5]
圖7 mRNA-1777 （V171） 胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測（FACS，A 年輕人，B老年人）[5]
mRNA-1345疫苗基于mRNA-1777進(jìn)一步進(jìn)行序列設(shè)計和密碼子優(yōu)化，以增強抗原的翻譯表達(dá)和激活的免疫原性。臨床試驗結(jié)果顯示，在老年人中，單次接種 mRNA-1345（50、100 或 200 μg）可使針對 RSV-A 的中和抗體滴度提高 14 倍，RSV-B提高10 倍，且老年人對疫苗的耐受性良好?；诖藬?shù)據(jù)，F(xiàn)DA已授予mRNA-1345用于60歲及以上老年人群的快速通道資格（FTD），mRNA-1345目前處于III期臨床試驗階段。
PART 03
RSV疫苗臨床生物分析內(nèi)容
隨著越來越多的RSV疫苗獲批上市和進(jìn)入臨床階段，RSV疫苗的評價方法也越來越重要。RSV疫苗產(chǎn)品的臨床生物分析主要包括RSV中和抗體、結(jié)合抗體、RSV病毒載量以及細(xì)胞免疫等內(nèi)容。
圖8 RSV疫苗檢測的四種方法[6]
RSV中和抗體是RSV疫苗臨床評價的重要指標(biāo)。傳統(tǒng)的中和抗體檢測方法為噬斑減少中和試驗（Plaque Reduction Neutralization Test, PRNT）和微量細(xì)胞中和試驗，此外，基于ELISA、ELIspot等技術(shù)的中和抗體檢測方法可通過針對病毒蛋白的抗體對感染細(xì)胞中病毒蛋白進(jìn)行檢測，具有簡單、快速、高通量和高度敏感性等優(yōu)勢，且在多種RSV疫苗和預(yù)防性抗體的中和抗體檢測中均有適用。
圖9 RSV中和抗體檢測方法[7]
PART 04
結(jié)語
熙寧生物|精翰生物以分析科學(xué)為核心能力，為新藥臨床與臨床前研究提供專業(yè)技術(shù)服務(wù)。在疫苗臨床研究領(lǐng)域，我們擁有完善的檢測平臺和一站式檢測服務(wù)能力，開發(fā)了基于ELISA、Fluorescence、Luminescence高通量的中和抗體評估方法，具有基于ELISpot、ICS的細(xì)胞免疫檢測能力，支持中美、中澳、多中心、大樣本量的臨床試驗，有著豐富的海外樣品進(jìn)口經(jīng)驗。
熙寧生物|精翰生物在RSV臨床研究領(lǐng)域的項目檢測經(jīng)驗非常豐富，可提供一體化、高效率的臨床生物分析服務(wù)，包括：
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細(xì)胞學(xué)方法進(jìn)行血清中RSV-A和RSV-B中和抗體滴度檢測
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ELISA/MSD方法進(jìn)行血清中RSV 抗F蛋白的特異性抗體濃度檢測
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RT-qPCR方法進(jìn)行RSV病毒載量檢測
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ELISPOT方法進(jìn)行RSV抗原多肽特異性T細(xì)胞反應(yīng)檢測
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